甘露糖结合凝集素基因多态性与中枢神经系统脱髓鞘疾病的关系分析

胡 瑾 张晓丽 苏 华 赵丽敏 赵雪聪 郜 岳

1.河北北方学院第一附属医院神经内科，河北张家口 075000；2.河北北方学院电镜室，河北张家口 075000；3.河北北方学院第一附属医院检验科，河北张家口 075000

中枢神经系统脱髓鞘疾病是临床上较为常见的 一组疾病，在病理上以中枢神经系统多灶性脱髓鞘、炎症为主，病因上与自身免疫相关的一组临床疾病，病因复杂，至今尚未阐明。甘露糖凝集素（mannosebinding lectin，MBL）是人体内重要的天然抗感染免疫分子[1]，若MBL发生基因突变，则会导致缺损或异常，机体对外界病原体的易感性则发生变化，从而影响先天免疫能力。MBL与炎症、自身免疫性疾病和抗感染免疫等关系密切[2-4]。本研究利用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析的方法，观察中枢神经系统脱髓鞘患者MBL基因第54号密码子多态性分布，探讨MBL基因多态性与中枢神经系统脱髓鞘疾病之间的关系。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集 2009年 1月～2012年 12月河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）神经内科患中枢神经系统脱髓鞘疾病病例45例（疾病组），其中男18例，女 27 例，发病年龄为 12～72 岁，平均（38.2±2.6）岁。 其诊断按照1983年Poser提出的诊断标准[5]。对照组为来我院进行体检的健康人员（健康对照组），共计60例，其中男 38例，女 22例，年龄为 25～65岁，平均（43.6±5.2）岁，无免疫病史和严重感染史。本研究经我院伦理委员会通过，研究对象知情同意并签署知情同意书。两组一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 样本的收集及处理

疾病组在入院当天采集静脉血，健康对照组在体检当日抽取静脉血，均随机进行编号。采用EDTA-K2抗凝管收集静脉血。将部分静脉血放入离心管中进行离心，离心10 min，转速10 000 r/min，分离出血浆，放入EP管中，-80℃保存。

另取部分血液采用DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）进行提取备用。即：取1 mL抗凝静脉血，在样品中加入3 mL红细胞裂解液 ，颠倒混匀，室温放置5 min，期间再颠倒混匀几次。10 000 r/min离心1 min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200 μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。加入20 μL Proteinase K溶液，混匀。加入200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min。加入200 μL无水乙醇，充分震荡15 s，所得溶液加入吸附柱CB3中，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液，向吸附柱 CB3中加入500 μL缓冲液GD，12 000 r/min离心 30 s，倒掉废液，向吸附柱 CB3中加入 600 μL漂洗液 PW，12 000 r/min离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中，然后置于室温放置数分钟，将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50～200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。

1.3 方法

采用河北北方学院贾天军等[6]建立的MBL ExonⅠ54位基因突变检测方法进行操作。PCR扩增目的DNA：引物：5′-AGGGCATGCTCGG-TAAAT-3′、5′-CTCATATCCCCAGGCAGTT-3′。凝胶图像分析系统拍照，记录。

1.4 统计学方法

计算出中枢神经系统脱髓鞘疾病组和对照组MBL基因的各种基因型频率和等位基因频率，使用SPSS 12.0软件包进行数据统计处理，利用卡方检验，分析MBL在各组间的差别，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在所检测到的45例中枢神经系统脱髓鞘疾病患者甘露糖凝集素基因ExonⅠ 54位密码子点突变中，野生型（GGC/GGC）为 34例，占 75.56%；突变杂合子型（GGC/GAC）为 10例，占 22.22%；突变纯合子型（GAC/GAC）为 1例，占 2.22%。基因频率：GGC 为86.67%，GAC为13.33%。对照组野生型（GGC/GGC）为30例，占50.00%；突变杂合子型 （GGC/GAC）为28例，占46.67%；突变纯合子型（GAC/GAC）为 2例，占3.33%。基因频率：GGC为73.33%，GAC为26.67%。两组基因点突变频率比较，中枢神经系统脱髓鞘疾病患者GGC/GGC基因型频率增高，而GGC/GAC基因型频率降低，差异均有显著性；中枢神经系统脱髓鞘疾病患者GGC等位基因频率高于健康对照组，而GAC等位基因频率低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 中枢神经系统脱髓鞘疾病组、健康对照组基因点突变频率的比较

3 讨论

MBL是一种C型凝集素，属于 Ca2+依赖型凝集素，是一种与先天免疫防御相关的血清凝集素，广泛存在于人和动物体内。人的MBL基因定位于10号染色体长臂上（10q11.2～q23），长约 7 kb，含有 3 个内含子，4个外显子，cDNA全长约 30 kb，有4个编码区，包括mbl1和mbl2两个基因，但mbl1是一种假基因，mbl2是人们通常说的MBL基因。人的MBL多以二聚物、三聚物和四聚物的形式存在。MBL主要由肝细胞产生，经分泌入血，其存在形式有两种，一是游离存在，另一种是与细胞膜结合，以膜结合蛋白形式存在，膜结合蛋白型广泛分布于白细胞、枯否细胞、血小板、内皮细胞、巨噬细胞等。这种分布形式与MBL的先天免疫反应功能有关。它能够识别糖配体，启动补体系统活化系统，促进吞噬、免疫调节作用，抑制、中和病毒作用，也是精卵识别的信号受体之一。

MBL作为机体的防御屏障，在保护机体，抵抗致病菌的入侵方面发挥了重要作用。MBL发挥免疫防御功能依赖于其在血清中的浓度和四级结构的多聚形式，血清中MBL水平降低将导致机体调理吞噬功能低下，易患感染性疾病。薛玉玮等[7]报道在系统性红斑狼疮患者血清MBL水平显著低于健康志愿者，特别是活动期系统性红斑狼疮患者血清MBL水平降低尤为明显，而且血清 MBL水平较低的患者更易发生比较严重的感染。

MBL基因结构区变异及启动子区基因不同的调节活性将影响血液循环中MBL水平，MBL基因点突变导致有功能的MBL分子血清水平大大降低，将导致调理缺陷，先天性免疫力削弱。机体易遭病原体侵袭；另一方面，其激活补体级联反应，而补体活化又可能造成自生组织损伤。因此，MBL与临床许多疾病密切相关，近年来国内外学者研究MBL水平降低与克隆氏病，1、2型糖尿病，呼吸道感染和类风湿性关节炎等疾病有关[2，4，8-12]。 血清中 MBL含量较低者终生处于高度的感染风险之中，随时可感染各种疾病，甚至威胁生命。

中枢神经系统脱髓鞘疾病是以中枢神经系统炎性、多灶性脱髓鞘为主的自身免疫系统疾病，以反复发作，多次缓解、复发为特征。严重危害人体健康，尽管许多年来国内外学者对其进行了大量深入地研究，但其病因及发病机制迄今仍未阐明。因MBL与自身免疫性疾病中的关系非常密切，笔者采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）法检测了45例中枢神经系统脱髓鞘疾病和60例健康志愿者的MBL基因多态性的分布，结果显示中枢神经系统脱髓鞘疾病组GGC/GGC基因型频率增高，而GGC/GAC基因型频率降低，差异均有显著性；中枢神经系统脱髓鞘疾病患者GGC等位基因频率高于健康对照组，而GAC等位基因频率低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明MBL基因突变与中枢神经系统脱髓鞘疾病发病有关，可能是该病发生的危险因素。

MBL与中枢神经系统脱髓鞘疾病的发生密切相关，随着对MBL的深入研究，对进一步揭示中枢神经系统脱髓鞘疾病的发病机制将起到积极作用。如何控制血浆中MBL的浓度水平来治疗中枢神经系统脱髓鞘等自身免疫性疾病，这将为攻克这类顽症提供新的思路。

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