秸秆发酵产氢菌系的筛选及菌系功能强化研究

刘建一，辛刚

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，大庆163319，2.佳木斯市质量技术监督局）

在世界能源严重危机的今天，生物质能成为仅次于石油、天然气和煤的第四种重要能源，它是通过绿色植物的光合作用，将太阳能转化为有机物中，囤积在生物体内的一种能量。中国是农业大国，每年产生大量的秸秆等农业废物[1]，如何将这些生物质能开发出来是目前我国科研领域的一大热点[2-3]。在以往的微生物秸秆发酵研究中，通常研究纯菌对秸秆类物质降解的效果，这种方法没有考虑到自然条件下微生物的协同关系，试验从牛粪堆肥中筛选得到能够降解秸秆产氢的菌系，并用生物方法对该菌系进行功能强化，提高菌系的秸秆降解率和产氢率。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

纤维素产氢复合菌系样品来自佳木斯周边牛粪堆肥。

1.2 秸秆来源

水稻秸秆从建三江农场采集，将取到的秸秆洗净，然后高温将其烘干，剪成长度小于等于1 cm的秸秆段待用。

1.3 培养基配制

富集培养基：RFT培养基[4]。

秸秆培养基 （L-1）：NH4Cl 1.0 g，K2HPO41.5 g，K2HPO43.5 g，NaCl 1.0 g，MgCl20.5 g，KCl 0.2 g，酵母粉2.0 g，半胱氨酸0.5 g，秸秆5 g，蛋白胨2.0 g，维生素液[5]5 mL，微量元素溶液[5]1 mL，刃天青1.5mg，pH 7.0。

纤维二糖培养基：K2HPO43.5 g，NH4Cl 1.0 g，K2HPO41.5 g，MgCl20.5 g，半胱氨酸0.5 g，NaCl1.0 g，KCl 0.2 g，蛋白胨2.0 g，纤维二糖10 g，酵母粉2.0 g，维生素液[5]5 mL，微量元素溶液[5]1 mL，刃天青1.5mg，pH 8.5。

滤 纸 培 养 基 （L-1）：NH4Cl 1.0 g，1.5 g，MgCl2K2HPO43.5 g，K2HPO40.5g，NaCl 1.0 g，KCl 0.2 g，酵母粉2.0 g，半胱氨酸0.5 g，蛋白胨2.0 g，滤纸5 g，维生素液[5]5mL，微量元素溶液[5]1mL，刃天青1.5mg，pH 9.0。

如需配制固体培养基，即在原有的成分中另外添加20 g·L-1的琼脂。

将各种培养基分装于血清瓶内，在培养基配制的全过程中用高纯氮气瓶，连接金属细针吹脱去除血清瓶中的氧气，在121℃条件下，高压灭菌20min。

1.4 秸秆发酵产氢菌系的富集与筛选

1.4.1 复合菌系的富集

分别称取不同部位采集到的牛粪堆肥样品10 g，装入带有数颗玻璃珠的无氧无菌水中，置于摇床中振荡培养1 h，利用玻璃珠之间碰撞产生的剪切力将样品分散开，使样品中的微生物均匀暴露于液体中。再将所得混合体系接种于富集培养基中，接种量为10%，37℃静止富集10 d，将混合体系转接到秸秆培养基中，接种量为10%，37℃静止富集10 d，连续转接两次，分别测定是否有氢气产生，有氢气产生即为纤维素产氢菌系。

1.4.2 连续稀释转接获得高效产氢菌系

选取降解秸秆产氢效果较好的菌系，用无菌水将所得菌系进行梯度稀释，取稀释度为10-3～10-9的菌液分别接种到秸秆培养基中，37℃恒温振荡培养，每隔24 h取样利用气相色谱测定（4890，Agilent）产氢效果，当测得产氢量升高，及时将菌系再次稀释10-2～10-9倍，不断重复此过程以得到高产氢复合菌系。

1.5 秸秆发酵产氢纯菌的分离与筛选

以纤维二糖为底物制作固体培养基，分别取5mL培养基注入厌氧管中，全程用高纯氮气吹脱，高压灭菌后，待培养基温度降至50～60℃时，分别取菌液0.5、1.0、1.5、2.0mL，注入厌氧管中，每浓度设置3组重复。采用改良的Hungate[6-7]厌氧滚管技术，将菌种均匀分布在厌氧管中，放于恒温箱中，37℃倒置培养20 d，待菌落长出后，分别挑取单一菌落接种到厌氧滤纸液体培养基中，120 r·min-1培养，观察滤纸的崩解情况，定期在显微镜下观察菌种状态，反复分离3～5次，待观察到菌体形态一致即认为是纯菌。

1.6 秸秆降解率测定方法

将发酵后的液体离心，收集剩余秸秆用蒸馏水冲洗，反复冲洗离心后，放于恒温箱中，烘干待质量不变化后测重。

秸秆降解率=（原始秸秆质量-残留秸秆质量）/原始秸秆质量×100%。

1.7 原子力显微镜观察

将培养得到的新鲜菌体培养液进行梯度稀释后，吸取10～15μL的悬浮液置于无菌载玻片上，将菌体固定10 min后，利用原子力显微镜（DI BioScope，Veeco）成像观察。

1.8 产氢菌系的生物学特性

将分离的纯菌在光学显微镜下观察。

1.9 菌系生物强化效果研究

准备若干瓶新鲜的培养基，分别向培养基中接种比例为10%的菌系CYY，将这些菌系分别培养到5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 h待用，培养菌株CYY-9，待其处于生长对数期时使用。将处于对数时期的菌株CYY-9分别接种到已经培养的菌系CYY培养基中，接种量分别为1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%。混合培养24 h后，按时测定不同组合的总产氢量（mL·L-1culture），每组做三个重复，取平均值。

2 结果与分析

2.1 秸秆发酵产氢菌系的富集筛选

富集得到能在秸秆培养基中生长，并具有较好的产氢效果的菌系。将该菌系梯度稀释后接种于新鲜培养基中，每24 h测定氢含量，当氢含量上升时，说明此时菌系中利用秸秆产氢的微生物活性强，反复将其稀释转接，从而得到产氢含量较高的菌系CYY。

2.2 产氢菌系的生物学特性

2.2.1 菌体的形态及生长曲线

图1为显微镜（油镜）下菌系形态图，图中有长短不一的杆状菌，吸附在秸秆周围。由菌体的生长曲线可见，菌株CYY在培养16到60 h时处于对数期，当培养到55 h，菌体的生长趋于平缓，说明达到稳定期，故应该选择培养40 h到55 h的菌体进行接种。60 h以后菌体的生长开始下降，此时菌体间争夺营养，同时可能某些菌体产生的代谢产物对菌系的生长起到抑制作用。

图1 菌系CYY吸附秸秆效果图Fig.1 Strains of CYY adsorption straw renderings

图2 菌图体3 菌生体长生量长量随随培时养间变时化间曲变线化曲线Fig.2 The cave of strain growth with time

图3 不图同4 温不同度温下度菌下菌体体的的生生长长情情况况Fig.2 The state of strains in different temputure

图4 不同pH条件下菌体生长情况Fig.4 The state of strains growth in different pH

2.2.2 菌系生长的最适温度

将菌株CYY在温度分别为25、30、35、40、45、50、55、60℃的条件下恒温培养后，分别测定OD值，得到图3所示的结果，该菌能在25～60℃的温度范围内生长，当环境温度较低时，不适于菌体的繁殖，当温度达到37℃时，菌体的生长量最大。当温度高于最适生长温度时，由于高温使菌体内的蛋白质逐渐失活，导致菌体的状态量下降。

2.2.3 菌株生长的最适pH值

将菌株分别转接到pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的发酵培养基中，在温度为37℃的条件下培养3 d，测定菌的生长量，得到结果如图4，该菌体在酸性条件下可以生长，但是生长量很低，当pH为8.5时，菌体的生长量达到最大值1.37，同时当pH在9左右也有较高的生物量，该菌的性质满足作洗涤剂的条件，该研究为该菌系在洗涤剂方面的应用研究奠定了基础。

2.3 菌系的产氢效果

在37℃，pH为8.5的条件下，对菌体连续传代17次，菌系产氢趋于稳定，氢气产量为90 mL·L-1culture，氢气含量为13.4%，秸秆降解率为39.3%。

2.4 秸秆发酵产氢纯菌的筛选结果

将菌系CYY培养到对数期后，立即进行10-1梯度稀释，采用改良的Hungate厌氧滚管技术，反复对菌体进行分纯，经多次纯化后，观察到厌氧管上菌落形态一致，认定为纯菌。将得到的单菌落分别接种到新鲜培养基中进行纯培养，分离得到5株细菌，分别用CYY-9、CYY-11、CYY-12、CYY-14、CYY-15命名。

将所得菌株接种于秸秆培养基，进行静态产氢实验，几株菌均可以对分解滤纸，其中CYY-9和CYY-11两株菌崩解滤纸效果最好。比较各菌产氢效果，结果见表1。由表中数据可知，菌株CYY-9有较好的产氢效果，选择CYY-9作为后续研究对象。

表1 各菌株产氢效果比较Table1 The effetof producetion hydrogen by strain separated

2.5 菌株CYY-9形态及生长特性

利用原子力显微镜观察，如图5，菌株CYY-9为杆状菌，周边无鞭毛，菌体表面光滑。此菌的最适生长温度为37℃，最适生长pH值为8.5。菌株CYY-9在固体培养基中菌落表面光滑均匀，呈白色，不透明。

图5 菌株CYY-9形态图Fig.5 The characterization of strain JYB-13 under AFM

2.6 菌系生物强化效果

将菌株CYY-9接种到菌系中的最初一段时间内，各试验组中样品的产氢能力均表现出下降趋势，有些组甚至出现不产氢的现象，这种现象可能是由于菌系内部各菌株长期适应性的结果，个菌体在菌系中比例稳定，数量和功能相互协调，当有外来菌株侵入时，导致菌系内部的组成结构变化，菌系内各菌需适应新的环境，所以导致产氢能力呈暂时下降趋势。由表2可知，当菌系培养到40 h左右，接种菌株CYY-9，接种量为4%时，复合菌系的产氢能力最强，产氢量达到103 mL·L-1culture，在菌系培养初期添加菌株CYY-9时，此时接种量较低，两部分菌株暂时可以同时生长，产氢结果与未添加CYY-9时的菌系相差不多。随着样品的培养时间延长，当菌系生长达到对数期时，菌系内部结构和功能越来越稳定，适应能力增强，此时接种较少的菌株CYY-9，复合菌系中的各菌共同生长，菌系中各种产氢菌能力均能得到极大地发挥。当菌系生长到稳定期以后再接种菌株CYY-9，效果较差，此时菌系生长能力稳定，甚至逐渐出现衰退，菌种产生的某些代谢产物可能对新填入的品种产生毒害作用，各部分的产氢能力很难发挥出来。

表2 不同复配条件菌系产氢量/m L·L-1 cultureTable2 The componentof straw under defferent disposing/mL·L-1 culture

3 结论

实验从牛粪堆肥中筛选出一个能降解秸秆，有较好产氢效果的菌系CYY，菌系生长的最适温度是37℃，最适生长pH为8.5，在秸秆培养基中，氢气产量为90mL·L-1culture，氢气含量达到13.4%，秆降解率为39.3%。

利用改良的Hungate厌氧滚管法，在菌系CYY中筛选得到一株能够较好的降解秸秆产氢的菌株CYY-9，此菌形态为杆状，最适生长温度为37℃，最适生长pH值为8.5。

将菌系CYY培养到40 h左右，将菌株CYY-9以一定比例接种到菌系中，测定得到当菌株CYY-9接种量为4%时，复合菌系的产氢能力最强，产氢量达到103mL·L-1culture，增长率为12.9%，秸秆降解率达49.2%，增长率为25.5%，达到对菌系CYY产氢能力强化的目的。

[1]陈洪章.纤维素生物技术[M].北京：化学工业出版社，2005.

[2]李鹏，孙可伟，柴希娟.秸秆的综合利用[J].中国资源综合利用，2006，24（1）：23-27．

[3]李永峰，徐菁利，张文启，等.生物制氢细菌分离培养与分子鉴定技术进展[J].上海工程技术大学学报，2006，20（2）：124-128.

[4]丁继峰，张东杰.玉米胚芽蛋白酶解工艺条件优化研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（5）：68-72.

[5]Kumar S，Tamura K，NeiM.MEGA3：Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence Alignment[J].Brief Bioinform，2004（5）：150-163.

[6]周瑶，王颖，安宇，等.奶酪中产杆菌样细菌素乳酸菌的分离与鉴定[J].黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（3）：60-63.

[7]Levin D B，Islam R N，Cicek R.Sparling.Hydrogen Production by Clostridium thermocellum 27405 from Cellulosic Biomass Substrates[J].Hydrogen Energy，2006，31：1496-1503.