高效液相色谱法测定血浆中乌头碱的含量

曹海莹

黑龙江省庆安县公安局，黑龙江 庆安 152400

乌头类中药因其具有治疗风湿痹证、跌打损伤等显著疗效，被广泛应用于中医临床。川乌、草乌和雪上一支蒿等乌头属中草药均含有乌头碱类成分［1-2］，既是乌头类中药的有效成分又是毒性成分，其安全范围窄，治疗量与中毒量接近，同时由于患者的个体差异，对其耐受性不一，常引起误服中毒或投毒［3-4］。由于乌头碱中毒无特异性临床表现，难以对其进行中毒鉴别，建立血浆中乌头碱的测定方法对法医鉴定及临床诊断具有重要意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 日本岛津高效液相色谱仪 (LC-6A泵，SCL-6B系统控制箱，Anastar色谱工作站);离心机(SANYO);YKH-1型液体快速混合器;PB153-S型电子分析天平 (瑞典梅特勒-托利多)。

1.2 药品与试剂 乌头碱标准品 (批号:110720-200410，中国药品生物制品检定所提供);乙晴为色谱纯，水为双蒸水。其余试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 血液样品的前处理 在经志愿者同意后，采取静脉血2ml置于离心管中，3000r/min离心，取血浆 0.5ml加0.5ml氨水混匀后加入4ml乙醚震荡萃取，提取10min后置于离心机上3000r/min离心5min，吸取上清液3ml于试管中，用N2吹干后加入0.4ml甲醇备用。

2.2 色谱条件 色谱分离柱:Hypersil ODS2(4.6mm，200mm);流动相:0.005mol/L溴化四丁铵:乙晴=65∶35(v/v);检测波长:235nm;流速:1ml/min;进样量:20μl;柱温:32℃。

2.3 实验溶液的配制 精密称取乌头碱标准品1000μg，置于2ml容量瓶中，加入纯净水定容，精密配制成为500μg/ml的乌头碱标准溶液备用。0.005mol/L溴化四丁铵水溶液。

2.4 标准曲线 按照参考文献将乌头碱对照品配制成0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μg/ml 不同浓度溶液，按上述色谱条件测定，以色谱峰面积与血浆浓度计算线性回归方程，即Y=190354X+69984，其相关系数r=0.9997，线性范围 0.1-5.0μg/ml。

2.5 精密度实验 将配置的 0.2、0.8、3.2μg/ml的乌头碱溶液，按本文所述条件检测，连续监测6次，以乌头碱色谱峰面积计算其RSD为0.19%。

2.6 稳定性实验 将配置的0.8μg/ml的乌头碱溶液按本文所述条件检测，每间隔2h检测一次，其RSD为0.68%，12h内稳定。

2.7 回收率实验 取0.2μg/ml的乌头碱溶液3份，每份分别加对照溶液，以乌头碱色谱峰面积计算其平均回收率，去其平均回收率为98.8%。

2.8 样品测定 取口服附子药酒及服用含附子中药的志愿者的血浆100μl，共3批次，每个样品测定3次，按本文所述条件方法测定色谱峰面积，测得样品中乌头碱的含量见表1。

3 应用案例

死者男性，63岁。连续饮用自制高浓度药酒，每次四两左右，约30min后相继发生口、唇、舌、四肢发麻等症状，经抢救无效后死亡。法医尸检提取死者血浆和所引药酒送检，采用上述HPLC法进行测定，所饮药酒和死者血浆中均检出乌头碱成分。死者血浆中乌头碱浓度为0.22μg/ml，药酒中乌头碱浓度为 53.2μg/ml。死者饮用该药酒在200ml以上，实际摄入乌头碱的量已大于1.064×104μg，超出成人口服乌头碱致死量，本案应系乌头碱急性中毒死亡。

表1 样品测定结果

4 讨论

含有乌头碱的中药在中医临床中大量应用，由于其毒性较强，常有乌头碱中毒的事件发生。本文对采自口服附子药酒及口服含有附子的中药汤剂的志愿者的血清进行乌头碱检测，检测结果具有乌头碱检出，虽低于乌头碱中毒剂量，但其如长期服用乌头碱在体内蓄积很可能引发其中毒。通过本文研究建议人们不要擅自服用含乌头碱的药酒或汤剂，必须服用时要在专业医生的指导下进行，并随时观察身体反应，如有不适及时就医，防止其中毒发生［5-6］。文献报道高效液相色谱法检测乌头碱，其准确度、精密度和萃取回收率上都达到了生物分析的要求，能满足法医毒物分析［7-8］。该分析方法血浆用量少，样品处理方法简单，减少了乌头的分解和损失环节，提高了检出率。若待测血中乌头碱含量较低时，可通过增大取样量或减小定容体积等手段来富集。

［1］范丽丽，郑作文，杨柯.毒性中药附子量效关系的实验研究［J］.四川中医，2011，29(5):53-57.

［2］陈芙蓉，邹大江，闪仁龙.近10年含乌头碱类植物中毒原因及解毒办法文献分析［J］.时珍国医国药，2012，23(12):3116-3118.

［3］金鸣，李红海，王升.高效液相色谱法快速分离测定血浆中的乌头碱［J］.中国法医学杂志，2005，20(4):215-217.

［4］刘伟，沈敏，秦志强.乌头急性中毒死亡者乌头生物碱的体内分布［J］.法医学杂志，2009，25(3):176-178.

［5］粟贵，廖林川，颜有仪.HPLC同时测定生物样品中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的含量［J］.中国药学杂志，2009，44(12):946-950.

［6］艾路，孙莹，张宏桂.复方中药中乌头生物碱在人体内的代谢产物［J］.北京中医药大学学报，2007，30(6):417-418.

［7］郭丹，林静瑜，周春权.高效液相色谱法测定家兔血浆中的乌头碱浓度［J］.海峡药学，2011，23(12):32-34.

［8］杨媛，黄建梅，刘小青.常态及虚寒状态小鼠体内次乌头碱的血药浓度差异研究［J］.中国中药杂志，2010，46(15):2008-2011.