保暖风的薄层色谱鉴别及其紫丁香苷HPLC法含量测定

2014-10-16 10:39唐秀玲唐秀利
中国民族民间医药 2014年17期
关键词:紫丁香薄层药材

唐秀玲 唐秀利

1.广西食品药品检验所,广西 南宁 530021;2.广西壮族自治区柳州市柳铁中心医院,广西 柳州 545007

保暖风为传统瑶药“五虎九牛十八钻七十二风”之风药,来源为瑞香科植物结香Edgeworthia chrysantha Lindl.的全株[1]。分布河南、陕西、长江流域及以南各省区,广西各地均有分布[1-3]。保暖风味甘、性温,归肾、肝经,其根、茎、花可分别人药,根和茎具有舒筋活络,消肿止痛功效;花具有养阴安神、明目、祛障翳之功效[4]。为保护、收集、整理和发展广西民间瑶药资源,广西食品药品监督管理局拟出版《广西瑶族习用药材质量标准 (第一卷)》,对瑶族习用药材进行质量控制指标研究,建立质量标准,保暖风是其中品种之一。

保暖风 (结香)化学成分研究报道[4-6]主要含香豆素类、黄酮类、甾类、有机酸化合物等,其中伞型花内酯、西瑞香素等成分含量测定方法已有报道[7]。本文采用7-羟基香豆素、紫丁香苷对照品及保暖风对照药材作薄层色谱鉴别的对照,建立两个薄层色谱鉴别,结果斑点圆整、清晰,重复性好;用高效液相色谱法测定紫丁香苷含量,采用甲醇回流提取制备供试品,用乙腈-水 (9∶91)为流动相,紫丁香苷与其它杂质峰分离良好,按照《中国药典》2010年版一部附录[8]“中药质量标准分析方法验证指导原则”进行方法学验证,结果表明该方法专属性强,稳定性、重现性好,结果可靠,可作为保暖风质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪,2487紫外检测器,Empower色谱工作站;MILLIPORE纯水处理器;MIKRO 22R型高速冷冻离心机;梅特勒电子分析天平。

1.2 试药 7-羟基香豆素 (批号:11739-200501)、紫丁香苷 (批号:111574-200201)购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯,水为高纯水,其它试剂均为分析纯。保暖风分别采集于广西金秀县桐木镇、资源县两水乡、贺州市开山镇、金秀县长垌乡、桂林市、金秀县六巷乡,柳州市鹿寨县、桂林市龙胜县、桂林市恭城县等地,经鉴定为瑞香科植物结香Edgeworthia chrysantha Lindl。

2 薄层色谱鉴别

2.1 7 -羟基香豆素的鉴别 取保暖风粉末1g,加甲醇30ml,超声处理20min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取保暖风对照药材1g,同法制定对照药材溶液,再取7-羟基香豆素对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法 (中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液和对照药材溶液2~4μl、对品溶液1~2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚 (60~90℃)-乙酸乙酯 (6.5∶3.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加至斑点显色清晰。置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色和对照品谱相应的位置上,显相同的蓝色荧光斑点,见图1。

2.2 紫丁香苷的鉴别 取本品各2g,加甲醇50ml,超声30分钟,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加水25ml使溶解,加石油醚 (60~90℃)提取两次,每次25ml,弃去石油醚液,再加三氯甲烷提取两次,每次25ml,弃去三氯甲烷液,水液加水饱和的正丁醇提取两次,每次25ml,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取保暖风对照药材2g,同法制定对照药材溶液,再取紫丁香苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含1mg溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法 (中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取供试品溶液和对照药材溶液5~10μl、对品溶液2μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以氯仿-甲醇-甲酸 (6∶1.2∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干。置紫外灯 (254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色和对照品谱相应的位置上,显相同的斑点,见图2。

3 紫丁香苷含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱:SPOLAR C18(5μm,4.6mm×250mm);检测波长:264nm;流速:1.0ml/min;柱温:35℃,流动相:乙腈-水 (9∶91),进样量10μl。在上述色谱条件下,紫丁香苷峰形良好,与相邻峰达到基线分离。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液的制备 取紫丁香苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含20μg的溶液,即得。

3.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末约1g,精密称定,置烧瓶中,精密加甲醇50ml,密塞,称定重量,加热回流提取30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

3.3 稳定性考察 对同一供试品溶液 (BNF-5),每隔一定时间测定一次,共测定9次,RSD为0.95%。试验表明,在24小时内被测物稳定。

3.4 线性范围考察 精密称取紫丁香苷对照品10.33mg,置50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密吸取 1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml,分 别 置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10μl,按3.1色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标 (X),峰面积积分值为纵坐标 (Y),绘制标准曲线,结果表明:紫丁香苷进样量在0.04132~2.066μg范围内,进样量与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为:Y=2.5173×106X-3.0990×103,r=1.0000。

3.5 精密度试验

3.5.1 仪器精密度试验 取同一供试品溶液 (BNF-5),按“3.1”色谱条件,连续测定6次,进样量为10μl。结果6次测定结果紫丁香苷峰面积的平均值为902489,RSD为0.49%(n=6)。试验表明,本法的精密度良好。

3.5.2 重复性试验 取同一供试品 (BNF-5),按拟订的方法平行测定6份,结果紫丁香苷含量的平均值为1.76mg/g,RSD为1.6%(n=6)。果表明本法的重复性好。

3.6 准确度试验 精密称取已知含量的保暖风0.5g(BNF-5,紫丁香苷含量为1.7622mg/g),共六份,分别精密加入紫丁香苷甲醇溶液 (紫丁香苷含量0.7710mg/ml)1ml,挥去甲醇,按“3.2.2”的方法提取、测定,计算加样回收率,结果紫丁香苷的加样回收率为101.2%,RSD=1.3%(n=6),符合方法学的要求,详见表1。

表1 加样回收试验结果

3.7 耐用性考察 用不同品牌色谱柱:SPOLAR C18(5μm,4.6mm × 250mm)、Alltima C18(5μm,4.6mm ×250mm)、XBridge C18(5μm,4.6mm ×250mm)进行分离、测定,结果紫丁香苷在上述色谱柱中均得到良好的分离,理论板数分别为5638、10368、5763。平均含量分别为1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g,RSD为0.56%。

3.8 样品测定 按“3.2.1”、“3.2.2”制备对照品溶液和10批样品溶液,照“3.1”项下色谱条件测定,按干燥品计算样品中的紫丁香苷的含量。10批样品中含量最高的是BNF-5为0.196%;含量最低的是BNF-6为0.023%。结果见表2。

表2 10批样品测定结果

4 讨论

4.1 供试品溶液制备方法的确定 本研究采用单因素试验,对提取溶剂 (甲醇、乙醇)、提取方法 (超声、回流)、提取溶剂的量 (15、25、50、100ml)和提取时间(15、30、60、90、120mim)依次进行考察,结果表明,甲醇25ml,加热回流30分钟,可提取完全。

4.2 测定波长的选择 取紫丁香苷对照品溶液及供试品溶液,按以上色谱条件进样,在反相高效液相色谱系统上实现对紫丁香苷的分离后,以二极管阵列检测器测定它的紫外光谱图,结果紫丁香苷对照品与保暖风样品均在221nm和264nm处有最大吸收,由于221nm干扰较大,故选择检测波长为264nm。

4.3 所建立的薄层色谱方法及含量测定方法简便快捷,重复性好,结果准确可靠,能有效控制保暖风的质量,可作为保暖风的质量标准的主要控制指标。

[1]戴斌.中国现代瑶药[M].广西:广西科学技术出版社,2009:233-235.

[2]江苏新医学院.中药大辞典 (下册)[M].上海:上海科学技术出版社,1993:2080-2081.

[3]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草 (第5册) [M].上海:上海科学技术出版社,1999:415-416.

[4]徐玲,蔡正洪.结香的化学成分及药理研究进展[J].安徽农业科技,2011,39(31):19110-19111.

[5]盛柳青,颜继忠,童胜强,等.结香茎皮化学成分的研究[J].中国中药杂志,2009,34(4):495-496.

[6]童胜强,颜继忠,叶用君,等.结香花化学成分的研究[J].时珍国医国药,2006,17(1):44-45.

[7]徐敏,颜继忠,童胜强.结香茎皮中伞型花内酯和西瑞香素的RPHPLC法测定[J].中草药,2008,39(2):288-289

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部) [M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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