保暖风的薄层色谱鉴别及其紫丁香苷HPLC法含量测定

唐秀玲 唐秀利

1.广西食品药品检验所，广西 南宁 530021;2.广西壮族自治区柳州市柳铁中心医院，广西 柳州 545007

保暖风为传统瑶药“五虎九牛十八钻七十二风”之风药，来源为瑞香科植物结香Edgeworthia chrysantha Lindl.的全株［1］。分布河南、陕西、长江流域及以南各省区，广西各地均有分布［1-3］。保暖风味甘、性温，归肾、肝经，其根、茎、花可分别人药，根和茎具有舒筋活络，消肿止痛功效;花具有养阴安神、明目、祛障翳之功效［4］。为保护、收集、整理和发展广西民间瑶药资源，广西食品药品监督管理局拟出版《广西瑶族习用药材质量标准 (第一卷)》，对瑶族习用药材进行质量控制指标研究，建立质量标准，保暖风是其中品种之一。

保暖风 (结香)化学成分研究报道［4-6］主要含香豆素类、黄酮类、甾类、有机酸化合物等，其中伞型花内酯、西瑞香素等成分含量测定方法已有报道［7］。本文采用7-羟基香豆素、紫丁香苷对照品及保暖风对照药材作薄层色谱鉴别的对照，建立两个薄层色谱鉴别，结果斑点圆整、清晰，重复性好;用高效液相色谱法测定紫丁香苷含量，采用甲醇回流提取制备供试品，用乙腈-水 (9∶91)为流动相，紫丁香苷与其它杂质峰分离良好，按照《中国药典》2010年版一部附录［8］“中药质量标准分析方法验证指导原则”进行方法学验证，结果表明该方法专属性强，稳定性、重现性好，结果可靠，可作为保暖风质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器，Empower色谱工作站;MILLIPORE纯水处理器;MIKRO 22R型高速冷冻离心机;梅特勒电子分析天平。

1.2 试药 7-羟基香豆素 (批号:11739-200501)、紫丁香苷 (批号:111574-200201)购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。保暖风分别采集于广西金秀县桐木镇、资源县两水乡、贺州市开山镇、金秀县长垌乡、桂林市、金秀县六巷乡，柳州市鹿寨县、桂林市龙胜县、桂林市恭城县等地，经鉴定为瑞香科植物结香Edgeworthia chrysantha Lindl。

2 薄层色谱鉴别

2.1 7 -羟基香豆素的鉴别 取保暖风粉末1g，加甲醇30ml，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取保暖风对照药材1g，同法制定对照药材溶液，再取7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法 (中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液2～4μl、对品溶液1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚 (60～90℃)-乙酸乙酯 (6.5∶3.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加至斑点显色清晰。置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色和对照品谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点，见图1。

2.2 紫丁香苷的鉴别 取本品各2g，加甲醇50ml，超声30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，加石油醚 (60～90℃)提取两次，每次25ml，弃去石油醚液，再加三氯甲烷提取两次，每次25ml，弃去三氯甲烷液，水液加水饱和的正丁醇提取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取保暖风对照药材2g，同法制定对照药材溶液，再取紫丁香苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法 (中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液5～10μl、对品溶液2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸 (6∶1.2∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯 (254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色和对照品谱相应的位置上，显相同的斑点，见图2。

3 紫丁香苷含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱:SPOLAR C18(5μm，4.6mm×250mm);检测波长:264nm;流速:1.0ml/min;柱温:35℃，流动相:乙腈-水 (9∶91)，进样量10μl。在上述色谱条件下，紫丁香苷峰形良好，与相邻峰达到基线分离。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液的制备 取紫丁香苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

3.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末约1g，精密称定，置烧瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.3 稳定性考察 对同一供试品溶液 (BNF-5)，每隔一定时间测定一次，共测定9次，RSD为0.95%。试验表明，在24小时内被测物稳定。

3.4 线性范围考察 精密称取紫丁香苷对照品10.33mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取 1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml，分 别 置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10μl，按3.1色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标 (X)，峰面积积分值为纵坐标 (Y)，绘制标准曲线，结果表明:紫丁香苷进样量在0.04132～2.066μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为:Y=2.5173×106X-3.0990×103，r=1.0000。

3.5 精密度试验

3.5.1 仪器精密度试验 取同一供试品溶液 (BNF-5)，按“3.1”色谱条件，连续测定6次，进样量为10μl。结果6次测定结果紫丁香苷峰面积的平均值为902489，RSD为0.49%(n=6)。试验表明，本法的精密度良好。

3.5.2 重复性试验 取同一供试品 (BNF-5)，按拟订的方法平行测定6份，结果紫丁香苷含量的平均值为1.76mg/g，RSD为1.6%(n=6)。果表明本法的重复性好。

3.6 准确度试验 精密称取已知含量的保暖风0.5g(BNF-5，紫丁香苷含量为1.7622mg/g)，共六份，分别精密加入紫丁香苷甲醇溶液 (紫丁香苷含量0.7710mg/ml)1ml，挥去甲醇，按“3.2.2”的方法提取、测定，计算加样回收率，结果紫丁香苷的加样回收率为101.2%，RSD=1.3%(n=6)，符合方法学的要求，详见表1。

表1 加样回收试验结果

3.7 耐用性考察 用不同品牌色谱柱:SPOLAR C18(5μm，4.6mm × 250mm)、Alltima C18(5μm，4.6mm ×250mm)、XBridge C18(5μm，4.6mm ×250mm)进行分离、测定，结果紫丁香苷在上述色谱柱中均得到良好的分离，理论板数分别为5638、10368、5763。平均含量分别为1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g，RSD为0.56%。

3.8 样品测定 按“3.2.1”、“3.2.2”制备对照品溶液和10批样品溶液，照“3.1”项下色谱条件测定，按干燥品计算样品中的紫丁香苷的含量。10批样品中含量最高的是BNF-5为0.196%;含量最低的是BNF-6为0.023%。结果见表2。

表2 10批样品测定结果

4 讨论

4.1 供试品溶液制备方法的确定 本研究采用单因素试验，对提取溶剂 (甲醇、乙醇)、提取方法 (超声、回流)、提取溶剂的量 (15、25、50、100ml)和提取时间(15、30、60、90、120mim)依次进行考察，结果表明，甲醇25ml，加热回流30分钟，可提取完全。

4.2 测定波长的选择 取紫丁香苷对照品溶液及供试品溶液，按以上色谱条件进样，在反相高效液相色谱系统上实现对紫丁香苷的分离后，以二极管阵列检测器测定它的紫外光谱图，结果紫丁香苷对照品与保暖风样品均在221nm和264nm处有最大吸收，由于221nm干扰较大，故选择检测波长为264nm。

4.3 所建立的薄层色谱方法及含量测定方法简便快捷，重复性好，结果准确可靠，能有效控制保暖风的质量，可作为保暖风的质量标准的主要控制指标。

［1］戴斌.中国现代瑶药［M］.广西:广西科学技术出版社，2009:233-235.

［2］江苏新医学院.中药大辞典 (下册)［M］.上海:上海科学技术出版社，1993:2080-2081.

［3］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草 (第5册) ［M］.上海:上海科学技术出版社，1999:415-416.

［4］徐玲，蔡正洪.结香的化学成分及药理研究进展［J］.安徽农业科技，2011，39(31):19110-19111.

［5］盛柳青，颜继忠，童胜强，等.结香茎皮化学成分的研究［J］.中国中药杂志，2009，34(4):495-496.

［6］童胜强，颜继忠，叶用君，等.结香花化学成分的研究［J］.时珍国医国药，2006，17(1):44-45.

［7］徐敏，颜继忠，童胜强.结香茎皮中伞型花内酯和西瑞香素的RPHPLC法测定［J］.中草药，2008，39(2):288-289

［8］国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部) ［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.