人组织激肽释放酶6在前列腺癌中的表达和意义

许小兵 王军起

江苏徐州医学院附属医院泌尿外科 徐州 221002

人类组织激肽释放酶基因(Kallikrein gene，KLKs)是一个近年来逐步被全面认识和发展的基因家族。有许多相关报道显示该基因家族与恶性肿瘤有关，涉及肿瘤入侵、转移，参与肿瘤血管生成。与其关系最密切的疾病是激素依赖性肿瘤，即起源于前列腺、乳腺、卵巢、子宫等性激素相关器官。研究表明，这些器官的癌变都出现了KLKs基因表达的异常［1－2］。有部分学者已开始进行该基因家族在抗肿瘤药物耐受、基因靶向性治疗等方面的研究［3－4］。KLK6是KLKs家族成员之一，1996年被Anisowicz［5－6］等最先证实，具有胰蛋白酶样活性，由肝脏、胰腺、脑神经等合成，广泛存在于人体组织和体液中，包括哺乳妇女的乳汁、血清、妊娠妇女羊水及男性精液，在人大脑、脊髓、小脑、肾、子宫、乳腺、胰腺、脑脊液、前列腺与口腔腺体中都有表达。本文通过对前列腺癌和前列腺增生组织中KLK6蛋白表达差异的研究，探讨其在前列腺癌诊断和预后中的价值。

1 材料与方法

1.1 材料 搜集2010－06—2013－10间徐医附院泌尿外科行前列腺根治手者前列腺组织标本，其中癌组织40例，Gleason评分≥7者为24例，＜7者16例;前列腺增生组织25例，所有标本均经徐医附院病理科确诊，所有PCa病例均为原发性前列腺肿瘤，无其他内分泌肿瘤并发症，术前均未接受放、化疗及其他辅助治疗，年龄55～78岁，平均65.3岁。

1.2 方法 采用免疫组织化学两步法检测KLK6表达情况。试剂采用兔抗人KLK6多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，DAB试剂盒、免疫组化检测试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，具体操作按试剂盒说明进行。

1.3 结果判定 KLK6蛋白主要定位于细胞浆［6］，免疫组化切片由两位富有经验的病理医师采用双盲观察，对结果进行评估，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性标准。

1.4 统计学处理 使用SPSS16.0软件进行数据处理，根据数据类型采用卡方(x2)检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌和前列腺增生组织中KLK6的表达 根据免疫组化结果，40例前列腺癌组织中有30例KLK6蛋白表达为阳性，阳性表达率为75%，增生组织中6例为阳性，阳性表达率为24%，癌组织于增生组织比较癌组织显著高于增生组织，两组比较差异有统计学意义。(x2=16.19，P＜0.01)，见表1。

表1 前列腺癌和癌旁组织KLK6阳性表达率比较

2.2 前列腺癌组织中低危和中、高危患者比较 吴阶平版实用泌尿外科学依据Gleason评分将前列腺癌患者分为低危、中危和高危，＜7的为低危，=7为中危，＞7为高危。将低危患者和中高危患者进行比较，低危患者共16例，KLK6蛋白表达阳性者为9例，阳性表达率为56.25%，中高危患者共24例，阳性者为21例，阳性表达率为87.5%，两者比较中高危患者明显高于低危患者(x2=5，P ＜0.05)，见表2。

表2 前列腺癌中低危和中高危患者KLK6蛋白阳性率比较

3 讨论

前列腺癌是欧美国家最常见的恶性肿瘤之一，2011年，有266 390个前列腺癌新增病例和37 820个死亡病例，已经成为欧美国家男性因癌症死亡的第二大因素［7－8］，仅次于肺癌。我国前列腺癌发病率虽远低于西方国家，但随着人口老龄化及饮食结构的改变，近年来明显增高。早期前列腺癌治疗效果肯定，多数患者可达到治愈的目的。但由于前列腺癌早期缺乏特异性临床表现，导致许多患者首次确诊时就已经发生转移而失去治性治疗机会。目前临床上应用广泛的是人激肽释放酶3即前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)，是诊断前列腺癌的重要指标，但诊断敏感性为75% ～85%，特异性只有25% ～35%，且不能可靠辨别前列腺癌是否具有威胁性［9］，还不能算是PCa早期诊断的最理想指标。因此寻找新的PCA早期诊断指标至关重要。本文通过对KLK6蛋白在前列腺癌组织和增生组织中的差异表达研究，显示其在前列腺癌早期诊断和预后分期中存在一定价值。

人类组织激肽释放酶基因(Kallikrein gene，KLK)家族是由位于19号染色体q13.4区域的300 kb基因序列组成，包含有15个人类组织激肽释放酶，横跨261—558bp，是一组高度保守的基因簇，是人类染色体丝氨酸蛋白酶的最大的家族。它们在核苷酸及蛋白水平上有很大的同源性，受类固醇激素的调节［10］。KLK6是该家族中的一员。1999年 Yousef［11］等采用 RT—PCR技术克隆出KLK6基因序列。他们研究发现，该基因由7个外显子和6个内含子组成，前两个外显子是非翻译的外显子，起始密码子Met位于第三个外显子末端上游的50bp处，终止密码子位于最后一个外显子起始点的下游156 bp处，内含子排列遵循I—II—I一0模式。它编码组织激肽释放酶蛋6(Human tissue kallikrein hK6)，被不同的研究组织分别命名为蛋白酶M(protease M)，neurosin和Zyme，是由223个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶。KLK6参与体内许多生化过程，包括蛋白激素的加工，血液凝固限速酶激活，组织重新分布和肿瘤进展，有介导特异蛋白水解作用。它可能通过以下机制促进肿瘤发生发展:(1)蛋白酶介导相邻细胞外基质的消化，促使肿瘤生长，肿瘤细胞脱落到周围环境中，提供转移器官基底膜侵犯的基础，促使多种血管生成因子和生长因子的释放及激活。Ghosh［12］等实验证实重组的hk6能分解大分子的胞外基质蛋白如胶原蛋白，纤连蛋白，层连蛋白，玻璃体结合蛋白等促进肿瘤浸润和转移。(2)KLK6在体外能裂解血纤维蛋白溶酶原产生一种抑制血管内皮细胞增殖的抑制片段，从而抑制血管再生［13］。(3)hk6和其他激肽释放酶、hepsin、SCCE(KLK7)、TADG－1、MMP－7等通过酶级联反应，导致肿瘤生长和播散［14］。

目前，KLKs与肿瘤之间的作用机制除了PSA外，都还处于起步阶段，还需要大量的研究和实验证实。已有研究证实其在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的作用。本研究通过免疫组化方法对前列腺癌和前列腺增生组织进行KLK6蛋白检测，结果显示，KLK6在前列腺癌和增生组织中表达差异显著，并且在前列腺癌不同组织分化阶段表达也有明显差异，提示KLK6可能参与了前列腺癌的发生和发展过程，推断KLK6在前列腺癌诊断和预后判断中起一定作用，可能成为早期前列腺癌辅助诊断和预后判断的重要指标。

［1］ Diamandis EP，Yousef GM，Clements J，Ashworth LK，Yoshida S，Egelrud T，et al.New nomenclature for the human tissue kallikrein gene family［J］.Clin Chem 2000;46:1 855 － 1 848.

［2］ Lundwall A，Clauss A，Olsson AY.Evolution of kallikrein－related peptidases in mammals and identification of a genetic locus encoding potential regulatory inhibitors［J］.Biol Chem 2006;387:243－249.

［3］ Xi Z，Kaern J，Davidson B，et al.Kallikrein 4 Is Associated with PacIitaxel Resistance in Ovarian Cance［J］.Gynecologic Oncology，2004，94(1):80 －85.

［4］ Nagahara H’Mimori K，Utsunomiya T，et al.CI inicopathologic and Biological Significance of Kal l ikrein 6 Overexpression in Human Gastric Cancer［J］.C1inical Cancer Research，2005，1l(19):6 800－6 806.

［5］ Diamandis EP，Yousef GM，Soosaipillai AR，et al.Immunofluorometric Assay of Human Kallikrein 6(Zyme/Protease M/Neurosin)and Preliminary C1inical Applications［J］.Clinical Biochemistry，2000，33(5):369 －375.

［6］ Petraki CD，Karavana VN，Skoufogiannis PT，et al.The Spectrum of Human Kallikrein 6(Zyme/Protease M/Neurosin)Expression in Human Tissues as Assessed by Immunohistochemistry［J］，Journal of Histochemistry and Cytochemistry，200l，49(11):1 431－1 441.

［7］ Siegel R，Ward E，Brawley O，Jemal A.Cancer statistics，2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths［J］.CA Cancer J Clin 2011:61:212－236.

［8］ Jemal A，Bray F，Center MM，Ferlay J，Ward E，Forman D.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011;61:69－90.

［9］ Thompson IM，Pauler DK，Goodman PJ，Tangen CM，Lucia MS，Parnes HL，et al.Prevalence of prostate cancer among men with a prostate－specific antigen level＜or=4.0 ng per milliliter［J］.N Engl J Med 2004:350:2 239 －2 246.

［10］ Bast RC Jr.Status of Tumor Markers in Ovarian Cancer Screening［J］.Journal of C1 inical Oncology，2003:21(10 Suppl):200－205.

［11］ Yousef GM，Luo LY，Scherer SW，et al.Molecular Characterization of Zyme/Protease M/Neurosin(Prss9)，a Hormonal ly Regulated Kal 1ikrein － Like Serine Protease［J］.Genomics，1999:62(2):251－259.

［12］ Ghosh MC，Grass L，Soosaipillai A，et al.Human Kallikrein 6 Degrades Extracellular Matrix Proteins and May Enhance the Metastatic Potential of Tumour CelIs［J］.Tumour Biology，2004，25(4):193 －199.

［13］ Bayes A，Tsetsenis T，Yentura S，et al.Human Kallikrein 6 Activity Is Regulated via an Autoproteolytic MechaniSill of Activation/Inactivation［J］.Biological Chemi stry，2004，385(6):517－524.

［14］ Tanimoto H，Underwood LJ，Shigemasa K，et al.Increased Expression of Protease M in Ovarian Tumors［J］.Tumour Biology，2001:22(1):11 －18.