脐血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化效果观察*

梁 丽，顾福嘉，黄国美#，杨大平，张玲玲，袁 军

1)贵州省人民医院消化内科 贵阳 550002 2)贵州省人民医院介入科 贵阳 550002 3)贵州省人民医院中心实验室 贵阳 550002

肝硬化是一种世界性的医疗卫生难题，该病在 我国发病率及病死率均较高，尤其是Child C级的失代偿期肝硬化，易并发多种并发症，患者生活质量低，目前尚无行之有效的治疗措施[1]。原位肝移植理论上是惟一有效的治疗措施，然而存在供体少、手术并发症多、排斥反应及费用高等诸多问题[2]。近年来，随着干细胞研究的兴起，国内外已有用干细胞移植治疗肝病的报道[3-5]。干细胞移植可促进肝细胞再生，改善肝功能[6]，且干细胞移植具有损伤小、并发症少、费用低廉、取材方便的特点，因此，干细胞移植有望为终末期肝病的治疗提供一种新的选择。贵州省人民医院于2009年5月至2012年5月利用负筛选混合法分离、纯化脐血干细胞，流式细胞术鉴定后在数字减影血管造影(DSA)指导下，于肝固有动脉过继回输治疗Child C级失代偿期肝硬化患者，现对该治疗方法的疗效、安全性总结报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2009年5月至2012年5月收治的30例失代偿期肝硬化患者，其中男22例，女8例，年龄39～76(57.0±3.9)岁。30例均为 Child C级，其中并发大量腹水21例，中度黄疸5例，肝性脑病3例，上消化道出血6例。30例中乙肝后肝硬化7例，酒精性肝硬化14例，乙肝与酒精混合性肝硬化5例，胆汁淤积性肝硬化2例，原因不明2例。所有病例进行干细胞移植治疗前均给予传统控制水钠摄入、保肝、纠正低蛋白血症等内科综合治疗2周，效果不佳，干细胞移植治疗前肝功能各项指标[包括血清白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)、凝血酶原时间(PT)等指标]均异常，Child分级仍然为C级，21例大量腹水患者B超测量腹水深度＞10 cm。所有患者干细胞移植治疗前均进行知情告知，并自愿签署知情同意书。

1.2 脐血干细胞的采集、分离、纯化及鉴定 脐血采集自贵州省人民医院产科分娩的健康产妇，排除病毒性肝炎、艾滋病、梅毒等传染病者，无病理妊娠。胎儿娩出后断脐，消毒采血部位，用装有保存液的一次性采血袋以封闭式采血法采血，每袋采集脐血约150 mL。该研究已经获医院伦理委员会审核通过。采取脐血前对所有产妇进行知情告知，产妇均自愿签署知情同意书。骨髓、脐血有核细胞体外分离试剂盒购自中国中航(宁夏)生物有限责任公司。用负筛选混合法分离、纯化脐血干细胞(严格按照试剂盒说明操作)，台盼兰染色，计数，观察纯化细胞的活性。荧光标记抗体CD45-PE和CD34-PerCP购自BD公司，细胞被抗体标记后上流式细胞仪检测。将细胞活性在95%以上、数量在1×107以上的干细胞用生理盐水5 mL制成细胞悬液。

1.3 治疗方法

1.3.1 术前准备 所有病例于术前行肝功能、凝血功能、甲胎蛋白(AFP)、腹部B超、肝脏CT+门脉CTA检查以及肝炎病毒、HIV病毒、梅毒等病原体检查，除外恶性肿瘤、其他重要脏器功能衰竭等禁忌证，并经内科综合治疗纠正肝性脑病、消化道出血、感染等并发症。

1.3.2 脐血干细胞移植 在DSA下经股动脉穿刺插管，置管于肝固有动脉，造影观察肝内血管情况，进一步除外肝脏占位病变。将分离提纯的脐血干细胞混悬液立即经导管从肝固有动脉灌注于肝脏，生理盐水10 mL冲管。术毕拔管，穿刺点加压包扎后返回病房，术侧下肢制动24 h，监测生命体征。

1.3.3 术后处理 所有患者术后仅给予常规保肝治疗，不输注白蛋白。

1.4 疗效观察 术后1周、2周、4周、8周、12周、半年及1 a随访，观察症状、体征及不良反应发生情况，并行肝功能、凝血功能、血常规、上腹部B超等相关检查。腹水控制效果以腹围、体重及B超测量腹水深度进行评价。腹围缩小＜5 cm为轻度缩小，5～cm为中度缩小，≥10 cm为明显缩小。体重减轻＜2.5 kg为轻度减轻，2.5～ kg为中度减轻，≥5 kg为明显减轻。腹水深度减少＜5 cm为腹水轻度减少，5～cm为中度减少，≥10 cm为明显减少。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0进行数据处理。不同时间点肝功能各项指标的比较采用重复测量数据的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 脐血干细胞的鉴定 每袋脐血经试剂盒分离纯化后至少可得数量在1×107以上的干细胞;光镜下可见细胞呈圆形，折光性强(图1);细胞活性在95%以上;经鉴定，分选后获得CD45+CD34－干细胞群。

图1 分离纯化的脐血干细胞光镜下表现(×200)

2.2 症状与体征的改善情况 30例患者均于移植术后1周腹胀、乏力、纳差等症状好转，体力及精神状况开始恢复，术后4周症状明显改善。

2.3 肝功能情况 见表1。脐血干细胞移植术后2周，患者ALB水平开始明显升高，并呈持续升高趋势。血清ALT水平于术后2周开始下降，术后12周时19例患者恢复正常，术后半年25例恢复正常。患者血清TB水平于术后1周开始下降，术后12周以后下降明显;5例术前TB＞150 μmol/L的患者中有4例于术后半年恢复正常。术后PT逐渐接近正常。

表1 患者治疗前后不同时间点肝功能各项指标测定结果(n=30)

2.4 腹水情况 术前对于有顽固性腹水的21例患者给予白蛋白输注，但腹水控制不佳，白蛋白水平上升不稳定。干细胞移植术后腹水恢复情况见表2。术后1周患者尿量增加，腹胀症状明显缓解，腹围缩小，体重减轻。B超结果显示，术后12周时16例腹水消失;术后半年时2例腹水轻度减少，2例腹水中度减少，但有反复，需间断输注白蛋白，其余患者腹水明显减少或消失，且表现稳定。

表2 干细胞移植术后21例顽固性腹水患者腹水情况 例

2.5 治疗后Child分级情况 30例术前肝功能均为C级。术后半年9例恢复至Child A级，17例恢复至Child B级，4例仍为Child C级。术后1 a，15例恢复至Child A级，12例为Child B级，3例仍为Child C级。

2.6 不良反应情况 术中30例患者均未出现出血、感染等并发症。术后均未发生发热、皮疹、呕吐、感染、疼痛、出血等与治疗相关的不良反应，患者耐受性较好。

3 讨论

干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞，可定向分化为功能细胞并用于器官损伤的修复。骨髓/脐血干细胞均是肝细胞的重要肝外来源，可在肝脏微环境下经细胞因子诱导分化为功能成熟的肝细胞，参与肝脏结构功能的修复和重构，能有效改善肝功能[7-9]，可为原位肝移植提供等待时间，甚至可使部分失代偿期患者恢复至代偿期。骨髓干细胞应用于临床较早，但抽吸骨髓为有创性操作。Child C级失代偿期肝硬化多为老龄患者，且多伴严重并发症(如顽固性腹水、凝血功能障碍、肝性脑病、中重度黄疸等)，难以耐受150～200 mL骨髓收集术，因此该类患者对于骨髓干细胞治疗依从性差。脐血干细胞移植取材方便，干细胞来源丰富，不额外增加终末期肝硬化患者的痛苦及治疗风险，无移植后排斥反应，更易于被患者接受。此外，研究[10]表明，与骨髓干细胞和外周血干细胞比较，脐血干细胞自我繁殖能力更强，干细胞得率也更大。因此，脐血干细胞是良好的潜在的细胞治疗源。

负筛选混合法是一种高效、可行的分离纯化干细胞的方法，其原理是在蛋白酶选择性地与非靶细胞结合后，通过密度梯度离心分离获得所需的靶细胞。由于是负筛选，所以收集的靶细胞没有被标记，回收的干细胞数量多、活性高，能完整保留生物学活性[10]。作者利用负筛选混合法分离、纯化脐血干细胞，可以从150 mL脐血中分离出1×107以上个干细胞，细胞活性可达95%以上。上述结果提示:负筛选混合法获得的脐血干细胞纯度高，数量及活性稳定，达到了细胞移植治疗的要求。

干细胞移植途径包括门静脉、股动脉、肝内注射、脾内、外周静脉、腹腔等，每种途径都有自己的优缺点，其中，在DSA指导下置管于肝固有动脉灌注干细胞的途径被较多地应用于临床，这样可以使干细胞能更有效地到达肝脏。该研究中30例患者均在DSA指导下，通过股动脉插管至肝固有动脉行干细胞灌注移植，术中、术后所有患者均未出现出血、局部血肿、感染等并发症。

Lyra等[11]对30例肝硬化失代偿期患者实施骨髓干细胞移植治疗，在移植术后第90天患者血浆白蛋白升高，Child评分改善。该研究术后定期随访的结果显示:脐血干细胞移植术后1周左右，多数病例乏力、纳差、腹胀等症状开始改善，术后4周左右症状明显缓解。该组患者ALB升高发生最早且明显，顽固性腹水的控制效果显著。脐血干细胞移植术后半年，9例患者肝功能恢复至Child A级，17例恢复至Child B级;术后1 a，15例恢复至Child A级，12例为Child B级。上述结果提示:经肝固有动脉过继回输脐血干细胞是一种潜在、有效的治疗Child C级终末期肝硬化的手段。

综上所述，过继回输负筛选混合法分离、纯化的脐血干细胞是一种具有巨大临床治疗潜能的、安全有效的治疗Child C级失代偿期肝硬化的方法。但此次研究病例数及观察时间有限，因此该治疗方法的中远期疗效还有待进一步总结;干细胞治疗的最佳途径、时机如何，治疗的稳定性如何，是否需要重复治疗等还需要进一步的研究总结。

[1]赵瑞娟，姚萍.失代偿期肝硬化198例预后因素分析[J].中国全科医学，2010，13(18):1975

[2]Demirag A，Bühler LH，Majno P，et al.Medical problems occurring during the long-term follow-up after liver transplantation[J].Swiss Surg，2003，9(5):237

[3]姚鹏，王帅，胡大荣，等.肝动脉自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化30例[J].世界华人消化杂志，2005，13(13):1639

[4]乔飞，张馨，盛云峰，等.脐带血干细胞治疗肝硬化失代偿期疗效观察[J].中国肝脏病杂志:电子版，2011，3(2):10

[5]陈海鸥，胡小宣，刘洪娟，等.脐血干细胞移植治疗肝硬化的疗效观察[J].中华肝脏病杂志，2010，18(7):537

[6]郭健，陈洪，王智.干细胞移植治疗肝硬化Meta分析[J].东南大学学报:医学版，2013，32(4):429

[7]Jang YY，Collector MI，Baylin SB，et al.Hematopoietic stem cells convert into liver cells within days without fusion[J].Nat Cell Biol，2004，6(6):532

[8]Kuo TK，Hung SP，Chuang CH，et al.Stem cell therapy for liver disease:parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells[J].Gastroenterology，2008，134(7):2111

[9]任红英，赵钦军，邢文，等.脐带间充质干细胞体外分化为有功能的低免疫原性肝细胞样细胞[J].中国医学科学院学报，2010，32(2):190

[10]江学良，权启镇，孙自勤.干细胞治疗失代偿期肝硬化应注意的问题[J].临床药物治疗杂志，2010，8(2):48

[11]Lyra AC，Soares MB，da Silva LF，et al.Infusion of autologous bone marrow mononuclear cells through hepatic artery results in a short-term improvement of liver function in patients with chronic liver disease:a pilot randomized controlled study[J].Eur J Gastroenterol Hepatol，2010，22(1):33