HSP70、JNK和p38在放线菌素D诱导的A549细胞凋亡中的作用*

王小龙，冯斐斐，孙鹏辉，李 杰，陆皓泉，阙菡雅，徐小艳，姚 武，周 舫#

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001 2)漯河市疾病预防控制中心应急办公室 漯河 462300 3)广西壮族自治区疾病预防控制中心环境卫生与地方病防制所 南宁 530028

肺癌是目前对人类危害最大的恶性肿瘤。近几十年来，其发病率和病死率都急剧上升，居世界癌症死因之首。目前，肺癌的治疗仍然以放化疗为主，关于肺癌治疗的研究也多集中于此。然而随着分子生物学的发展，近年来不断有新的肺癌疗法出现，如免疫疗法、基因疗法等[1]。热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是热休克蛋白家族的一个重要成员，它与肿瘤的发生、发展密切相关[2]。有研究[3]证实，HSP70在肿瘤细胞的凋亡过程中发挥重要作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的氨基末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)参与调控细胞凋亡过程，而Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者[4-6]。作者采用放线菌素D(actinomycin D，Act D)诱导人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡，分别用热处理、JNK和p38 MAPK通路抑制剂作用于Act D诱导过的A549细胞，用流式细胞术检测细胞凋亡率的变化，Western blot检测细胞中HSP70、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化p38(p-p38)和Caspase-3的表达水平，探讨 HSP70、JNK和 p38在 Act D诱导的A549细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 A549细胞由中科院上海细胞生物研究所提供。蛋白抽提试剂盒，eECL化学发光试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，Act D(北京Solarbio公司)，Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司)，Nanovue plus微量蛋白核酸测定仪(美国GE公司)。

1.2 Act D染毒剂量的MTT法确定 将对数生长期的细胞转移至96孔板中，每孔200 μL，在37℃、体积分数5%CO2环境下孵育至铺满孔底。分别加入终质量浓度为 0、5、10、20、40、60、80、160 mg/L 的Act D，每组设5个平行孔，继续培养12 h，加入20 μL的MTT(5 g/L)染液，放入培养箱中继续培养3 h，每孔加入 100 μL DMSO，室温摇晃 10 min，在 492 nm处检测吸光度，计算细胞致死率，根据MTT的结果选定所用的染毒浓度。

1.3 各组细胞凋亡率的流式细胞术检测 采用Act D作为染毒物，将对数生长期的细胞分为DMSO对照组(A组)、Act D染毒组(B组)、热处理(42℃，30 min)+Act D组(C组)、JNK抑制剂SP600125+Act D组(D组)和p38 MAPK抑制剂SB203580+Act D组(E组)5组。各组细胞在培养箱中培养24 h后，重悬，1000 r/min离心10 min，使用工作液200 μL重悬细胞于1.5 mL的EP管中，然后向各管中分别加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶5 μL，混匀后避光反应10 min上机检测。每组均设6个平行对照。

1.4 各组细胞中蛋白含量的Western blot法测定细胞培养及分组同1.3。使用蛋白抽提试剂盒提取各组细胞总蛋白，使用Nanovue plus微量蛋白核酸测定仪测定蛋白浓度，调整浓度，确保每孔上样量均为50 μg。将蛋白样品和上样缓冲液按比例混匀，100℃，5 min变性。与标准分子蛋白Marker同时上样，电泳条件为80 V 40 min，120 V 90 min。电泳结束后切胶，用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。用50 g/L的脱脂牛奶封闭2 h，使用TBST溶液洗脱3次，10 min/次，然后用一抗(抗体均购自北京博奥森生物公司，按1∶500稀释)4℃孵育过夜，二抗(按1∶2000稀释)常温孵育3 h以上，洗脱3次后，在暗室中进行eECL显影。用图像分析软件Quantity one分析条带的积分光密度。每组均设3个平行对照。

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0进行分析。应用方差分析和LSD-t检验比较各组细胞凋亡率、HSP70、p-JNK、p-p38以及Caspase-3表达水平的差异，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 实验染毒剂量的MTT法确定 MTT实验结果显示，随着Act D浓度的提高，A549细胞的致死率逐渐上升，Act D对A549细胞的半数致死浓度大约为75 mg/L，该实验选用20 mg/L作为染毒剂量。

2.2 各组细胞凋亡率以及 HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3的表达水平 见表1、图1。

表1 各组细胞凋亡率以及HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3的表达水平

图1 Western blot检测HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3表达水平

3 讨论

HSP70可由多种因素诱导产生，如应激、药物、肿瘤等。JNK和p38 MAPK作为MAPK超家族的重要成员，对细胞生存具有重要意义[4]。研究[7-9]证实，HSP70参与调控细胞凋亡过程，且该过程很可能与JNK和p38 MAPK通路有关。

为探讨HSP70、JNK和p38 MAPK在Act D诱导的A549细胞凋亡中的作用，作者分别采用热处理、JNK抑制剂SP600125和p38 MAPK抑制剂SB203580处理细胞，结果发现，与Act D组相比，以上3个处理组的细胞凋亡率明显下降。Western blot结果也进一步证明，经过Act D处理的A549细胞HSP70表达增加，而热处理、SP600125和SB203580能够降低Act D对A549细胞的作用效果，说明HSP70可能通过JNK和p38 MAPK通路来抑制细胞的凋亡过程。Gong等[9]研究发现，HSP70可能与MK2的磷酸化有关，而MK2参与了p38 MAPK通路磷酸化。由此可见，HSP70参与了细胞的增殖和凋亡过程，而这一过程涉及JNK或p38 MAPK的激活。徐勇等[10]用JNK和p38抑制剂作用于Jurkat细胞，发现2种抑制剂能够降低藤黄酸诱导的Caspase-3水平。

然而细胞凋亡涉及多个通路，目前已知的有线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路等[11]。HSP70可能同时与多个细胞信号通路共同参与细胞凋亡的调控，具体的机制还需进一步研究予以证实。

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