生理活性物质对遭遇低温逆境烟草抗性生理指标的影响

谢会雅，史端甫，张红兵，罗真华，段伶俐，周真珍，杨莉颖，贺利雄

（1. 湖南省烟草公司 株洲市分公司，湖南 株洲 412000；2. 湖南农业大学 资源环境学院，湖南 长沙 410128；3. 湖南农业大学 生物科学技术学院 湖南 长沙 410128）

烟草是原产于亚热带的喜温作物，其生长最适温度为25～28℃，10～13℃停止生长、1～2℃低温可使幼苗死亡，环境温度尤其是低温对烟草的生育、产量和品质都有明显影响。在湘南、湘西北和湘中烟区低温危害（即倒春寒）频发，导致早春移栽后烟苗受害、大田前期生长缓慢以及导致早花，严重引起烟叶产量和品质的波动，也一直制约优质烟叶生产的发展[1]，目前增强品种的低温耐性已成为烟草品种改良的主要目标之一。针对困扰烟草生产的“倒春寒”危害这一实际问题，通过遗传改良育成耐低温新品种是解决“倒春寒”危害的根本性策略，但这耗时周期长，且需要大量的人力、物力和财力。因此，通过农艺措施如喷施烟草低温耐性调节剂提高烟草幼株的低温耐性，不失为及时应对早春低温危害的一种方法。

研究报道表明，多种外源化学物质（生理活性物质）如甜菜碱[2-3]、聚乙二醇[4]、水杨酸[4-5]、5-氨基乙酰丙酸[6-7]和ABA、氯化钙、维生素C[8]等对植物的逆境抗性具有调节作用。本研究在低温逆境胁迫条件下，对叶面喷施水杨酸、甜菜碱、聚乙二醇和5-氨基乙酰丙酸烟草植株的抗寒性相关生理指标进行了检测分析，评价其改善烟草低温抗性的生理效果，以期为烟草苗期低温耐性调节剂有效组分的筛选提供初步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 田间试验材料

参试烟草品种为K326、由中国烟草中南试验站提供，采用烟草育苗专用基质和漂浮育苗法，依照烟草育苗技术进行肥水管理；出苗后1～2 片真叶期间苗、3～4片真叶期移植盆栽，幼苗至6～7 片真叶时（苗龄约55 d 左右)，选用生长旺盛、长势基本一致的幼苗供试验用。

1.2 室内实验设计及处理方法

选用与植物低温逆境抗性关系密切的水杨酸（SA）、甜菜碱（GB）、聚乙二醇（PEG 6000）和5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）4种生理活性物质（以清水为对照），叶面喷施浓度分别为（辅以0.1%Tween 20）：10 mg/L、15 mmol/L、2.5 mmol/L 和10%。

将供试烟苗移入人工气候室常温驯化3 d 后（22～25℃，5 000 lx、光照12 h），整株喷施生理活性物质溶液，以叶片上下表面湿透为度、喷施处理15 株；喷施处理24 h 后，开始低温逆境处理。

于2013～2014年用人工气候室(AGC-D003N，浙江求是人工环境有限公司)模拟“倒春寒”时期气候条件实施低温逆境胁迫处理（6～7℃，1 000 lx、光照12 h），期间正常水分管理。低温逆境处理第0、1、3、5、7 d，光照6 h后，选取中位成熟叶片进行叶片相对电导率测定，重复5次，并採集各处理鲜叶样品液氮冷冻、研碎，-80℃超低温冰箱保存，供后续理化分析用；用Excel 2010 处理实验数据。

1.3 叶片生理指标检测方法

生理指标定量分析检测依照《生物化学实验教程》[9]和《植物生理学实验技术》方法[10]、或略加改良后进行（重复3 次），比色法使用SP-752 紫外分光光度计(上海光谱)。检测方法：（1）相对电导率测定使用DDS-307 电导仪(上海雷磁）测定叶片组织外渗液的相对电导率；（2）叶绿素含量测定采用80%丙酮提取比色法；（3）可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法；（4）游离脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮比色法；（5）过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法；（6）丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法。

2 结果与分析

2.1 生理活性物质处理对烟草叶片细胞膜相对电导率的影响

当植物遭遇逆境胁迫时，半透性的细胞膜既是感受逆境胁迫的最敏感部位，也是细胞首先被“伤害”的部位，由于细胞膜的结构“受损”导致其透性增大、细胞内可溶性物质和电解质会被动地向膜外渗漏，细胞浸出液电导率的增大反映了质膜的伤害程度[11]。

从图1 可见，与低温处理前（0 d）相比，低温处理第1、3、5、7 d、对照的相对电导率分别增加44.82%、75.30%、102.70%和117.72%，而4种生理活性物质处理的电导率增长幅度均低于对照，分别为11.06%～23.25%、31.51%～47.91%、50.60%～59.45%和60.43%～73.03%。说明4种生理活性物质能减轻低温胁迫下烟草叶片受到的伤害、减少细胞溶质的外渗，对烟草细胞膜具有良好的保护作用，且4种生理活性物质中，5-ALA、SA 及GB 的效果优于PEG。

图1 生理活性物质处理烟草叶片细胞膜相对电导率的影响

2.2 生理活性物质处理对烟草植株可溶性糖、游离脯氨酸含量的影响

当遭遇逆境胁迫时，植物会主动调整自身代谢、强化专一的生理代谢，积累可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱等相溶性溶质来提高细胞液浓度、降低细胞水势和冰点，保护细胞膜结构的完整性[12]；防止蛋白质发生凝固变形，在细胞蛋白质(酶)高级结构的维持、翻译后的修饰和输运过程中发挥“小分子伴侣”的生理作用；此外，脯氨酸还直接参与逆境胁迫中O2-、OH-等活性氧清除过程[13]。因此，可溶性糖、脯氨酸等相溶性溶质的含量是植物逆境抗性的重要生理指标。

可溶性糖和游离脯氨酸含量的测定结果如图2 所示，低温胁迫引起了烟草体内可溶性糖和脯氨酸的积累。低温处理第1、3、5、7 d，对照的可溶性糖含量分别较低温处理前增加了8.30%、33.60%、83.40%和98.81%，SA、GB、PEG 和5-ALA 处理的可溶性糖含量的增长均高于对照，分别为17.98%～33.84%、53.18%～73.56%、96.25%～119.39%、117.98%～134.98%，4种生理活性物质的处理效果以5-ALA 略优、但差异不显著（图2a）。随着低温胁迫时间的延长，脯氨酸含量也表现出了与可溶性糖含量类似的变化，如低温胁迫第7 天，对照脯氨酸含量较低温胁迫前增加了84.51%，4种生理活性物质处理的烟苗脯氨酸含量增加幅度为93.90%～115.55%，显著高于对照（图2b）。

综合来看，4种生理活性物质处理均较对照进一步促进了低温逆境胁迫处理期间可溶性糖和脯氨酸的积累，对烟苗低温胁迫的响应能力具有明显的调节作用，可增强烟草植株的低温抗性。

2.3 生理活性物质处理对烟草叶片过氧化氢酶活性和丙二醛含量的影响

植物遭遇逆境胁迫时，富集的活性氧（ROS）直接氧化损伤细胞内生物大分子，引起一系列生理生化紊乱；同时，加剧膜脂质的氧化程度、破坏生物膜的完整性，增加膜脂质氧化产物丙二醛（MDA）的量。另一方面，植物体内过氧化氢酶（CAT）广泛存在，是植物组织细胞清除H2O2的主要保护酶，逆境胁迫下维持有较高的CAT 活性，可减轻活性氧的毒害作用、稳定膜结构，提高植物的抗逆性[14]。

图2 生理活性物质处理对烟草可溶性糖(a)、游离脯氨酸(b)含量的影响

从图3a 可看出，对照及各处理的烟苗CAT 活性随低温胁迫的延长持续下降，低温处理第1、3、5、7 d，对照较低温处理前分别降低18.16%、46.78%、70.17%和76.23%，4个生理活性物质处理的降低幅度分别为7.54% ～9.57% 、13.48% ～19.73% 、22.69% ～35.41% 、33.21%～45.61%，均低于对照组，显示出4种生理活性物质对CAT 具有较好的保护作用、CAT 维持有较高的活性。

图3 生理活性物质处理对烟草过氧化氢酶活性(a)、丙二醛含量(b)的影响

低温逆境胁迫可导致烟苗MDA 的产生，并随低温胁迫时间的增加而上升（图3b），如低温处理第3 天，对照较处理前增加了156.8%，而4种生理活性物质处理分别增加了62.21%、85.43%、103.42%、65.64%，明显低于对照，4种生理活性物质处理可减轻低温逆境胁迫下烟苗MDA 的增加，其中SA、GB 和5-ALA 的处理效果优于PEG 处理。

从CAT 活性和MDA 含量变化的结果来看，生理活性物质处理可减轻低温胁迫下烟草CAT 活性的下降，减缓生物膜脂质氧化损害、对细胞质膜系统具有良好的保护作用；另外，SA、GB 和5-ALA 这3种生理活性物质对烟苗低温耐性指标改善的生理效果比PEG 处理更为明显。

2.4 生理活性物质处理对烟草叶片叶绿素含量的影响

低温逆境胁迫将导致植物光合系统的“低温光抑制”，叶绿体色素被氧化“漂白”分解是光合系统的低温伤害之一[15]。此外，烟草生产中“倒春寒”发生时期的光照较弱，而在弱光照下植物的光合速率与叶绿素含量存在良好的线性关系，叶绿素含量直接影响着植物光合作用的水平[16]。

表1 所示结果表明，低温胁迫使烟草叶片叶绿素含量逐渐减少。低温处理第1、3、5、7 d，对照叶绿素含量分别较低温处理前减少了11.02%、22.83%、33.86%和39.37%，4种生理活性物质处理的减少幅度分别为3.97% ～6.35% 、8.73% ～13.60% 、16.67% ～23.26% 、21.43%～28.00%，均显著低于对照，表明这4种生理活性物质处理减缓了低温胁迫所导致的叶绿素分解速度，对叶绿素有一定的保护作用。低温胁迫下烟草的叶绿素保有量较高，可促进烟苗光合能力的维持，为保持烟苗的生长和营养吸收、增强烟苗的抗逆性提供基本保障。

表1 低温胁迫下生理活性物质处理烟草叶片叶绿素含量的变化

3 小结与讨论

本研究表明，喷施适宜浓度的水杨酸（SA）、甜菜碱（GB）、聚乙二醇（PEG）和5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），能促进低温胁迫下烟草可溶性糖和游离脯氨酸的积累、减轻过氧化氢酶活性和叶绿素含量的下降、降低烟草叶片的相对电导率和MDA 含量，从而提高了烟草植株的抗寒能力。另外，综合比较这4种生理活性物质的处理效果，初步确定SA、5-ALA 和GB 优于PEG，为烟草苗期低温耐性调节剂有效组分筛选提供了参考。

为了确保研究结果的准确性和实用性，后续研究中：①本实验使用的生理活性物质对植物抗寒性的其他机制如烟苗的根系活力、光合活性、水势、抗氧化系统等因素的影响有待进一步验证；②植物激素或植物生长调节物质对烟草生长发育、烟叶产量和品质等方面有较大的影响，本研究使用的生理活性物质在此方面、尤其是对烟草品质方面的影响如何有待检测分析。

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