低温胁迫对两种紫花苜蓿膜脂脂肪酸含量的影响

王 柏，苑芷茜，李东双，李志坚

（1. 东北师范大学草地科学研究所，植被生态科学教育部重点实验室，吉林 长春130024；2. 吉林师范大学生态环境研究所，吉林 四平136000）

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上广泛栽培的优良豆科牧草。近年来从国内外苜蓿品种在我国北方地区的引种试验和生产实践来看，国内外大多数优良苜蓿品种均存在生态不适应性问题，即在我国北方冬季气候干旱寒冷地区种植，其抗寒性、持久性表现较差。因此，选择抗寒性强的苜蓿品种是我国北方地区苜蓿成功建植的关键。

植物细胞膜的结构和稳定与植物抗寒性有着密切关系，一直是植物抗寒生理生态学的重点研究内容之一。Lyons 最早发现高抗寒植物较不抗寒植物具更高的不饱和脂肪酸含量[1]，除了受遗传特性的控制以外，外界的温度条件也能在一定程度上影响植物的脂肪酸不饱和度。大量研究表明，不饱和脂肪酸的含量随温度的降低而增加，在不饱和脂肪酸不断积累的过程中，植株的抗寒性也不断增强。品种间的抗寒性差异亦是在此低温期间表现出来的，即脂肪酸不饱和度高的植物抗寒性强于脂肪酸不饱和度低的植物[2-4]。同种植物即便取材于不同时期、不同部位，也能得此结论[5-7]。因此，可以通过适当的低温锻炼来提高植物的抗寒力。

苜蓿抗寒性很大程度取决于根颈对寒冷的忍耐力，有关苜蓿根颈抗寒的研究已有少量报道，而目前有关苜蓿膜脂脂肪酸与抗寒性的关系的研究主要是以苜蓿的幼苗及叶片为对象[8-10]，关于低温对根颈膜脂脂肪酸影响的文献未见报道。为了解苜蓿膜脂脂肪酸含量与抗寒性的关系，试验选用两种抗寒性不同的苜蓿品种，经自然低温处理后，对其根颈膜脂脂肪酸含量及其组分进行定量分析，以期为苜蓿抗寒种质资源鉴定、评价以及苜蓿抗寒品种选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料的准备和处理

供试苜蓿品种为WL-525HQ 苜蓿（极不抗寒）和肇东苜蓿（抗寒）。于2009年5月1 在东北师范大学试验地进行盆栽。花盆中装入过筛土壤，均匀播种，每个品种播种15 盆，每盆为一个重复。定期灌水、除草，9月初刈割一次。

10月下旬起，记录每日日平均气温，在气温不断下降的过程中取样。当连续7 d 的日平均气温平均值达0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃时取样，每品种3 次重复。样品经液氮迅速冷冻后，放入超低温冰箱中保存。室内试验在东北师范大学草地科学研究所实验室进行。

1.2 试验方法

1.2.1 膜脂的提取 将根颈剪碎混匀，取3 g 样品放入研钵用液氮研磨成粉，用氯仿-甲醇混合溶液进行膜脂提取。再加1%的NaCl 溶液将有机相充分洗涤后，水浴蒸干，即可得总脂。

1.2.2 极性脂的提取 根据液-液分离法，用石油醚反复冲洗去除中性脂，得到不含中性脂的极性脂溶液，水浴蒸干后得极性脂。

1.2.3 膜脂的甲酯化 用KOH-甲醇溶液法对干燥后的极性脂肪酸进行甲酯化，将上层清液直接进行气相色谱分析[11]。

1.2.4 膜脂中脂肪酸成分分析 采用Agilent6890 气相色谱仪进行脂肪酸成分的分析，柱温采用程序升温：150℃维持2 min，以15℃/min 升至240℃，维持5 min，汽化室250℃，检测室250℃。按照峰面积归一化法计算求得各脂肪酸在总脂中的相对含量。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下苜蓿根颈膜脂脂肪酸组成与其含量变化

WL-525HQ 苜蓿与肇东苜蓿根颈膜脂脂肪酸主要由棕榈酸（16︰0）、硬脂酸（18︰0）、油酸（18︰1）、亚油酸（18︰2）、亚麻酸（18︰3）组成。这5种脂肪酸占总膜脂脂肪酸的95%以上。各样本脂肪酸组成相同，但在不同温度处理下品种间含量配比存在差异（表1）。其中，饱和脂肪酸中以棕榈酸为主，占根颈总膜脂脂肪酸的12.09%～19.03%；不饱和脂肪酸中亚油酸为主，占根颈总膜脂脂肪酸的56.33%～68.17%，其次为亚麻酸，所占比例为14.28%～19.50%。

从整个低温过程中脂肪酸的变化幅度来分析，以棕榈酸与亚油酸的变幅最大，WL-525HQ 苜蓿中棕榈酸下降了2.60个百分点，亚油酸上升了4.57个百分点；肇东苜蓿中棕榈酸下降了5.44个百分点，亚油酸上升了5.09个百分点。且WL-525HQ 苜蓿中棕榈酸含量始终高于肇东苜蓿的，亚油酸含量则相反。这说明这两种脂肪酸对低温反应较为敏感；而硬脂酸、油酸、亚麻酸的变幅均较小，则说明这3种脂肪酸对低温反应不敏感。

2.2 低温胁迫下苜蓿根颈膜脂不饱和脂肪酸含量及IUFA 值的变化

由表2 可知，WL-525HQ 苜蓿与肇东苜蓿的根颈膜脂不饱和脂肪酸含量与IUFA 值随处理温度的降低均有不同程度的增加。对两种苜蓿根颈膜脂不饱和脂肪酸含量与温度进行相关性分析，结果显示WL-525HQ 苜蓿的不饱和脂肪酸含量与温度的相关系数为-0.969，呈极显著负相关（P＜0.01），肇东苜蓿的不饱和脂肪酸含量与温度的相关系数为-0.942，呈显著负相关（P＜0.05）；WL-525HQ 苜蓿与肇东苜蓿根颈膜脂中IUFA 值与温度的相关系数分别为-0.944 与-0.928，两个品种根颈膜脂中IUFA 值均与温度呈显著负相关（P＜0.05）。

从表3 中可看出，低温胁迫下，五种主要脂肪酸中亚油酸（18︰2）和棕榈酸（16︰0）的含量与两种苜蓿根颈膜脂不饱和脂肪酸的百分含量呈显著（P＜0.05）或极显著相关（P＜0.01），其中亚油酸（18︰2）含量与苜蓿膜脂脂肪酸不饱和度呈显著正相关，棕榈酸（16︰0）含量与苜蓿膜脂脂肪酸不饱和度呈极显著负相关（P＜0.01），而其他三种脂肪酸与苜蓿根颈不饱和脂肪酸百分含量没有显著相关性。同时，亚油酸与棕榈酸是苜蓿根颈膜脂中相对含量最多的两种脂肪酸。

表2 低温胁迫下苜蓿根颈膜脂不饱和脂肪酸含量及IUFA 值的变化

2.3 低温胁迫下苜蓿根颈膜脂脂肪酸组分与抗寒性的关系

表3 脂肪酸组分与不饱和脂肪酸百分含量之间相关的矩阵

目前普遍认为，不饱和脂肪酸含量越高，植物抗寒性越强。沈漫[12]认为，高抗寒植物之所以具有较多的不饱和脂肪酸，除自身遗传特性决定外，能相对快速的合成大量不饱和脂肪酸以适应低温环境。从表2 中可看到，两个品种的不饱和脂肪酸含量和IUFA 值两个指标在初始温度（0℃）的数值为最低，随温度的降低逐渐上升，均于-20℃达到最高。WL-525HQ 苜蓿的不饱和脂肪酸含量上升幅度达3.75%，肇东苜蓿上升幅度达6.53%；WL-525HQ 苜蓿的IUFA 值上升幅度达2.35%，肇东苜蓿的上升幅度达到5.51%。肇东苜蓿两个指标的上升幅度均大于WL-525HQ 苜蓿，并且在-5℃～-20℃下，两品种间的差异达显著水平（P＜0.05）。肇东苜蓿自身的不饱和脂肪酸含量以及低温下优先积累不饱和脂肪酸的能力均高于WL-525HQ 苜蓿。整个低温处理过程中，肇东苜蓿的根颈膜脂脂肪酸不饱和度与IUFA 值均高于WL-525HQ 苜蓿。由此可以推断，肇东苜蓿的抗寒性大于WL-525HQ 苜蓿，与多年田间冻害观测结果相一致。

3 结论与讨论

苜蓿根颈膜脂脂肪酸的组分随温度的变化而产生相应的规律性变化，随温度的下降，两个苜蓿品种的脂肪酸不饱和度与IUFA 值都有不同程度的上升，并均与温度呈显著或极显著负相关。证实了低温有助于苜蓿根颈膜脂不饱和脂肪酸的形成。

鉴定植物的抗寒能力除需要适当的研究方法，还需在适当方法之上建立正确的量化指标。通过前人的研究成果可总结出脂肪酸不饱和度、IUFA 值及一些与温度高度相关的脂肪酸都可以作为植物的耐寒性指标[13-15]。根据脂肪酸不饱和度与IUFA 值在低温下的变化对苜蓿抗寒性进行的综合评估，得出肇东苜蓿的抗寒性大于WL-525HQ 苜蓿，与多年的田间实验结果相一致。这也确定了脂肪酸不饱和度与IUFA 值均可作为评价苜蓿抗寒性的生理指标，并验证通过了盆栽试验鉴定苜蓿抗寒性代替传统的田间冻害观测的可行性。

亚油酸（18︰2）和棕榈酸（16︰0）不仅是苜蓿根颈膜脂脂肪酸中含量最多的两类，低温胁迫条件下，还与苜蓿根颈膜脂脂肪酸不饱和度显著相关。因此，亚油酸和棕榈酸含量的变化决定着苜蓿根颈膜脂脂肪酸的不饱和度。亚油酸含量增多，脂肪酸不饱和度增大；棕榈酸增多，脂肪酸不饱和度减小。因此，亚油酸和棕榈酸要比其他不饱和膜脂脂肪酸在苜蓿抗寒性方面的贡献更大，可以作为紫花苜蓿膜脂抗寒指示性脂肪酸。

[1]James M L，Craig M A.Solidificati on of unsaturated/saturated fattyacid mixtures and itsrelation ship tochil ling sensit ivityin plants[J].Journal of the American Oil Chemists Society，1965，42（12）：1056-1058.

[2]Yoshida S.Chemical and biophysical changes in theplas mamembrane duringcol dacclimation of mulberry barkcells（Morus bombycis Koidz.cv Goroji）[J].Plant Physiology，1984，76（1）：257-265.

[3]Cyril J，Powell G L，Duncan R R，etal.Changes inmembrane polarlipid fattyacids of seashore paspal uminres ponseto lowtem peratureex posure[J].Crop Science，2002，42（6）：2031-2037.

[4]马 程，董文倩，郑彩霞.油松针叶细胞膜脂肪酸组成的季节性变化研究[J].安徽农业科学，2010，38（19）：10303-10305.

[5]邓令毅，王洪春.葡萄的膜脂和脂肪酸组分与抗寒性关系的研究[J].植物生理学报，1982，8（3）：273-283.

[6]郭金铨，陈文涛，王振泉，等.菠萝叶膜脂脂肪酸组成的温度效应及其与抗寒性的关系[J].植物生理学报，1985，11（4）：319-327.

[7]杨广东，张战备，郭瑜敏，等.脂肪酸与青椒苗期和花期抗冷性关系[J].北方园艺，1999，（4）：1-2.

[8]Grenier G，Willemot C.Lipid changes in roots of frosthar dyand less hard yalfal favarietie sunder hardening conditions[J].Cryobiology，1974，11（4）：324-331.

[9]夏 明，刘亚学，阿拉木斯，等.低温下苜蓿叶片膜脂脂肪酸组分的研究[J].中国草地，2002，24（6）：28-37.

[10]王瑞云，任有蛇，岳文斌，等.低温胁迫对苜蓿幼苗存活及生理生化指标的影响[J].激光生物学报，2006，15（4）：342-348.

[11]张志良，瞿伟菁.植物生理学实验指导（第三版）[M].北京：高等教育出版社，2003.272-273.

[12]沈 漫.不同抗寒性的杜鹃品种叶片磷脂和脂肪酸组成差异性比较分析[J].南京林业大学学报，1997，21（2）：66-69.

[13]王孝宣，李树德，东惠茹，等.低温胁迫对番茄苗期和开花期脂肪酸的影响[J].园艺学报，1997，24（2）：161-164.

[14]余泽宁.龙眼叶片膜脂肪酸组分含量与龙眼耐寒性的关系[J].广西园艺，2003，（3）：4-5.

[15]张 玮，谢锦忠，吴继林，等.低温驯化对部分丛生竹种叶片膜脂脂肪酸的影响[J].林业科学研究，2009，22（1）：139-143.