2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶重组蛋白的制备及鉴定

杜骁杰，郭静静，王 晶，李 敏，王 玲，王长军，潘秀珍

0 引 言

蛋白质磷酸化是信号转导系统的核心，其中激酶和磷酸酶的协同作用介导着蛋白质可逆的磷酸化，精确地调控细胞的各项生命活动，包括细胞的生长、分裂、分化以及代谢等［1］。丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，STK)和 STP是蛋白质可逆性磷酸化的重要酶类，长期以来认为其只存在于真核生物中，近年来的研究表明，在原核生物中也存在真核样 STK 和磷酸酶［1－2］。

猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌，目前对其信号转导系统的研究主要集中在二元信号转导系统中［3－8］。我们的前期研究已分离出2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33，对其进行了全基因组测序分析［9］，发现和真核生物同源的stk/stp。本研究对stp进行原核表达及纯化，对纯化的重组蛋白进行酶活性测定，为进一步阐明STK/STP磷酸化系统的调控机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物 2005年S.suis 2 05ZYH33分离自四川资阳中毒性休克综合征患者。E.coli BL21、E.coli DH5α、pET28a 均由本实验室保存。pMD18-T购自Takara公司。对stp基因设计上下游引物，引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成，碱基序列如下碱基序列如下:STP-L:CATATGATGGCTTTTTCATCGGTCA(下划线为引入的Nde I酶切位点)，STP-R:CTCGAGTTACCTAGCCTCCTCCGT(下划线为引入的XhoⅠ酶切位点)

1.1.2 试剂 Taq polymerase、dNTP、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、DNA Marker和质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司，蛋白Marker购自Fermentas公司，PCR割胶回收试剂盒购自promega公司，蛋白表达诱导剂IPTG购自南京生兴生物公司。THB培养基购自美国Difco公司。HRP标记的羊抗鼠IgG、邻苯二胺(DAB)显色液购于武汉博士德生物工程有限公司;His-Tag单克隆抗体购自上海艾比玛特生物医学有限公司。pNPP stock购于ScienCell(美国)公司。Tris购于南京百斯凯公司。MnCl2、MgCl2和CaCl2购于广东汕头西陇化工股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 stp的生物信息学分析 根据S.suis中国强致病株05ZYH33的全基因组序列和注释结果，利用BLAST程序，对CDSSSU0427进行在线比对，并对蛋白进行保守功能域检索。MEGA 5.0软件绘制stp的进化树。

1.2.2 pET28a::stp的构建 用引物对 STP-L/STPR扩增05ZYH33 stp目的片段，将stp PCR产物连入pMD18-T并转化E.coli DH5α感受态，构建成功后测序比对，命名为 pMD18-T-stp。pMD18-T-stp和pET28a用NdeⅠ/XhoⅠ进行双酶切，酶切产物进行回收，回收产物经T4 DNA Ligase连接后转化E.coli BL21，对转化子进行PCR和酶切鉴定，成功后命名为pET28a::stp。

1.2.3 pET28a::stp的表达及纯化 将 pET28a::stp/BL21于5mL含Kana的LB培养基中过夜培养，1∶100加入新鲜培养基后，37℃振荡培养至A600值约0.6，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，16℃诱导培养。离心收集菌体并用超声波破碎细胞，离心后收集上清，利用Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白。12%SDSPAGE电泳检测目的蛋白的相对分子质量。

1.2.4 Western blot鉴定 取纯化的STP重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，采用电转印法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h;加His-Tag单克隆抗体(1∶4000)，4℃过夜;用HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶4000)孵育1 h;加DAB显色液显色。

1.2.5 酶活鉴定 参照文献［10］，重组蛋白的磷酸酶活性检测以pNPP为底物，通过测定A450值的变化间接检测酶的活性。将2 μg重组蛋白STP与5 μL pNpp stock混合后加入事先配置的反应缓冲液［含 1 μmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，2 mmol/L MnCl2、MgCl2或 CaCl2］，常温孵育，每隔1 min 检测 A405值。

2 结 果

2.1 05ZYH33 stp基因的生物信息学分析 通过Blastp比对发现STP蛋白的氨基酸序列与GenBank上的肺炎链球菌PhpP、变形链球菌pppL、无乳链球菌SaSTP和化脓链球菌SP-STP的氨基酸序列一致性分别为69%、59%、59%和60%。保守功能结构域检索发现STP属于金属依赖型磷酸酶家族PP2C亚家族，其在进化上也较为保守。见图1。

图1 S.suis 2 05ZYH33 STP的生物信息学分析Figure 1 Bioinformation of STP

2.2 重组表达载体pET28a::stp的构建和鉴定以05ZYH33基因组DNA为模板，STP-L/STP-R扩增stp全长基因，扩增产物大小约为810 bp，与理论值一致。将PCR扩增产物割胶回收进行纯化，与pMD18-T载体相连后测序，测序结果经比对正确，将stp连入pET28a后构建重组表达载体pET28a::stp，双酶切结果证实了pET28a::stp的成功构建。

图2 重组质粒的PCR及酶切鉴定Figure 2 Identification of the recombinant plasmid by PCR and restriction enzymes

2.3 pET28a::stp的表达及重组蛋白的纯化pET28a::stp/BL21经IPTG诱导后，16℃下诱导培养，超声波破碎细胞后离心收集上清及沉淀，SDS-PAGE分析表明，16℃下STP可正常表达，且主要存在于上清中。利用Ni2+亲和层析柱对表达产物进行纯化，250 mmol/L洗脱目的蛋白，透析去除咪唑，得到重组蛋白STP。见图3。

图3 pET28a::stp的诱导表达及STP纯化检测Figure 3 Expression of STP and the detection of purified STP protein

2.4 STP的 Western blot分析 Western blot结果显示，STP可以和His-Tag单抗发生反应，在蛋白相对分子质量大小约32 000处有明显的特异蛋白条带，说明该重组蛋白的确是stp的表达产物。见图4。

图4 用His-Tag单抗对重组表达蛋白进行免疫印迹检测Figure 4 Western blot of the recombinant STP

2.5 重组蛋白磷酸酶活性的鉴定 用含有3种不同离子(Mn2+、Mg2+或Ca2+)的缓冲液孵育蛋白与作用底物的混合物，通过检测A405值的变化，间接检测磷酸酶的活性。我们发现，只有Mn2+存在下，STP才具有磷酸酶活性，提示该蛋白具有金属离子依赖性。见图5。

图5 STP磷酸酶活性的间接检测Figure 5 Phosphatase assays of STP

3 讨 论

STP通过催化底物蛋白丝氨酸或苏氨酸磷酸化羟基的去磷酸化，完成对信号的传递。根据分子结构、对金属离子的依赖性以及对抑制剂的敏感性的不同，STP被分为两大家族，即磷蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatase，PPP)和金属依赖型磷酸酶(metal-dependent phosphatase，PPM)［11］。本研究在2型猪链球菌中发现STP编码基因stp，生物信息学分析显示STP蛋白属于PPM家族PP2C亚家族，该亚家族成员结构类似人蛋白质磷酸酶2C［11］。其与常见致病菌株肺炎链球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、变形链球菌STP蛋白具有很高的同源性，在进化上具有保守性。

在枯草芽孢杆菌中，stk/stp激活细菌孢子萌发的转录因子［12］。在金黄色葡萄球菌中，stk/stp调节细菌细胞壁的结构和对抗生素的敏感性［13］。无乳链球菌中，stk/stp影响着细菌的毒力和形态结构［14－15］。目前对stk/stp系统的研究主要集中在stk中，单独对stp的报道并不多见，且在某些菌株中stp是必须基因，对该基因不能进行突变研究［16］。本课题组前期发现 S.suis 2中国强毒株 05ZYH33 STK/STP编码基因，对激酶 stk进行敲除株的构建［17］。本研究针对stk相邻的磷酸酶stp开展相关研究，以05ZYH33基因组为模板扩增出stp基因，将其连入表达载体pET28a并转入宿主菌后进行原核表达，亲和层析获得了纯度较高的STP蛋白。

PPM家族蛋白的酶活性需要有金属离子(Mg2+或Mn2+)的参与［11］，本实验间接地测定出重组STP蛋白的磷酸酶活性，且只有在Mn2+存在的条件下才具有该活性，在Mg2+或Ca2+存在下则没有活性。本研究结果为进一步阐明STK/STP系统在猪链球菌磷酸化信号转导系统中的作用打下基础。

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