直肠癌组织中EB病毒的原位杂交检测

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(1 青岛大学附属医院普外科,山东 青岛 266003； 2 青岛市妇女儿童医院检验科)

直肠癌组织中EB病毒的原位杂交检测

闫海龙1，张建立1，胡顺霞2，崔建1，孙振青1

(1 青岛大学附属医院普外科,山东 青岛 266003； 2 青岛市妇女儿童医院检验科)

目的探讨EB病毒(EBV)感染与人直肠癌发生的关系。方法采用原位分子杂交技术,对100例人直肠癌组织标本中EBV编码小分子RNA(EBER)进行检测。结果100例直肠癌标本中癌细胞EBER均为阴性，有1例直肠癌组织间质中浸润的淋巴细胞EBER阳性。结论EBV感染与直肠癌的发生无明显相关性。

直肠肿瘤；单纯疱疹病毒属；原位杂交

EB病毒(EBV)为γ-DNA疱疹病毒，在全世界普遍存在，该病毒首次发现于非洲Burkitt淋巴瘤培养细胞中，之后又在其他淋巴和上皮性肿瘤中证实了该病毒的存在[1-2]。95%的健康人携带EBV。国内外的研究结果显示，EBV与多种肿瘤如霍奇金病、低分化鼻咽癌以及周围性淋巴瘤等的发生有密切关系[3]。EBV与肿瘤相关性的研究已逐渐引起人们的关注。目前，关于EBV与中国人胃肠道肿瘤关系的研究报道主要集中于EBV与胃癌的相关性方面[4-7]，而EBV与直肠癌发生的相关研究目前尚无明确的结论。本文采用原位分子杂交的方法对其进行检测，旨在研究EBV与中国人直肠癌发生的关系。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1标本及其来源

直肠肿瘤组织标本100例，取自2012年1—12月我院病理科保存的标本。其中黏液腺癌6例，低分化腺癌5例，中分化腺癌89例。病人男61例，女39例；年龄37～88岁，平均(61±10)岁。

1.2标本处理

标本经40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片2张，厚度为5 μm。其中一张病理切片用于原位分子杂交实验；另一张行苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察，进行组织病理学分类。

1.3EBV编码小分子RNA(EBER)检测

1.3.1探针合成及标记 根据EBER1序列设计原径杂交探针，其正义序列为5′-TCTGTGGCAGGA-GTGGTGGGCCCTGAACAT-3′，反义序列为5′-A-GACACCGTCCTCACCACCCGGGACTTGTA-3′，应用Roche公司提供的Dig Oligonucleotide 3′-end Labeling Kit对探针进行标记。

1.3.2分子杂交 石蜡包埋切片用二甲苯溶液脱蜡，体积分数1.00、0.90和0.70乙醇浸泡组织切片各5 min梯度水化，2×SSC洗片3 min共2次，200 g/L甲醛缓冲液固定20 min，2×SSC振荡洗片3 min共3次。然后滴加胃蛋白酶(1 mg/L)，放置于37 ℃温箱中，消化25～30 min，1 g/L甘氨酸溶液轻轻洗片约30 s，终止消化反应。2×SSC清洗1次，加预杂交液(每张切片80 μL)，加地高辛标记的EBER1寡核苷酸探针0.5 mg/L(终浓度)，盖玻片覆盖，于湿盒中37 ℃杂交反应过夜。次日用2×SSC洗去盖玻片，0.5×SSC洗片15 min共2次，去除杂交信号，应用EBV相关胃癌组织切片作为阳性对照，EBV阴性胃癌组织切片(采用正义探针序列)作为特异性对照。

1.3.3信号检测 用Blocking buffer封片40 min，加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，37 ℃反应1 h，使用Buffer1#振荡洗片15 min共2次，Buffer3#振荡洗片2 min，加入显色液，置入湿盒中37 ℃反应3 h，使用2×SSC洗片10～30 s，Buffer4#洗片3 min共3次，用5 g/L甲基绿复染15～20 min。待切片干燥后用中性树胶封片，显微镜下观察，细胞核浓染且呈紫蓝色者为EBER阳性信号。

2 结 果

本文100例直肠癌组织标本中所有癌细胞均未发现EBER阳性信号(图1A)。1例直肠癌组织间质中的淋巴细胞呈EBER阳性反应，阳性信号集中于淋巴细胞核内，呈紫蓝色(图1B)。EBV相关胃癌组织中癌细胞均检测到EBER阳性信号(图1C)，EBV阴性胃癌组织中癌细胞均无EBER阳性信号(图1D)。

A：直肠癌组织EBER阴性，背景为甲基绿染色，200倍；B：直肠癌组织间质淋巴细胞EBER阳性反应，紫蓝色为阳性信号，200倍；C：EBER阳性胃癌组织，紫蓝色为阳性信号，200倍；D：EBER阴性胃癌组织，背景为甲基绿染色，200倍。

图1直肠癌组织EBV的原位杂交检测

3 讨 论

直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，病因目前仍不十分明确，其发病的相关因素有生活环境、遗传、饮食等，直肠息肉也可作为独立的发病因素，与直肠癌密切相关。近年来，EBV逐渐受到人们的关注，一方面是由于其对人类的普遍感染，同时它也是传染性单核细胞增多症的病因；更重要的是，越来越多的研究表明，EBV与多种肿瘤的发生有关，国际癌症研究署将EBV列为第一类致癌因子[8]。大量研究已经证实，EBV与胃癌存在一定的相关性[4-6]。然而，EBV与直肠肿瘤相关性的研究，目前并无统一的结论，国内外研究报道的结果也不尽相同，大多数学者的研究结果显示EBV与直肠肿瘤的发生没有明显的相关性[9]。

本文实验采用EBER1原位杂交技术，检测100例直肠癌组织中EBV，未发现阳性结果，有1例癌组织间质中散在的淋巴细胞呈阳性反应，由于淋巴细胞通常是EBV潜伏感染的场所，从而形成EBER阳性反应。YUEN等[10]应用EBER1原位分子杂交方法，检测了36例结直肠腺癌中的EBV，未发现阳性病例，仅有肿瘤组织浸润的少量淋巴细胞EBV阳性，提示EBV潜伏于这些淋巴细胞中。本文结果与其一致。CHO等[11]采用EBER1原位杂交方法检测了274例结直肠癌、107例壶腹癌和142例食管癌EBV，结果显示仅有肿瘤组织中浸润的少量淋巴细胞呈现EBV阳性，结直肠癌、壶腹癌和食管癌之间差异无显著性，提示EBV与结直肠癌无明显相关。KIJIMA等[12]采用同样的方法检测了313例胃癌、107例食管癌、102例结直肠癌、75例肺癌、61例乳癌、58例胰腺癌、45例甲状腺癌EBV，结果显示，有23例胃癌EBV阳性，占7.6%，与CHO等[1]结果一致。然而，KIM等[7]对CD21抗原在EBV相关肿瘤中的表达研究结果显示，24例结直肠腺癌中有2例组织细胞呈EBER原位杂交阳性。KON等[13]对1例直肠淋巴上皮样癌行免疫组化、PCR及原位杂交检测，结果显示EBV与直肠淋巴上皮样癌之间关系密切。张建武等[14]采用PCR方法对112例结直肠肿瘤和非肿瘤的肠镜活检标本进行EBV DNA检测，结果显示EBV阳性率为2.9%，与CHO等[1]研究结果相符。虽然PCR检测EBV具有较高的灵敏度，然而由于扩增时无法保证只有肿瘤细胞DNA，相对于原位杂交来说，容易产生假阳性结果，特异性较差，因此本文选择了原位杂交方法，保证了实验结果的准确性。

与其他EBV相关肿瘤，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤等相比，EBV在直肠肿瘤组织中阳性率较低，说明EBV在直肠癌的发病过程中所起的作用可能有限。本文研究结果表明，100例直肠癌组织病理切片无EBV阳性者，结合以往研究结果，认为直肠癌的发生是多种因素共同作用的结果，EBV与直肠癌的发生无明显相关性。

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(本文编辑 黄建乡)

DETECTIONOFINSITUHYBRIDIZATIONOFEPSTEIN-BARRVIRUSINRECTALCANCER

YANHailong,ZHANGJianli,HUShunxia,CUIJian,SUNZhenqing

(Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between epstein-barr virus (EBV) and rectal cancer.MethodsApplying in situ molecular hybridization technique, the small-molecule RNA fragments of EBV in samples of 100 patients with rectal cancer were detected.ResultsEBV was not found in the cancer specimens. One of the cases was found infiltrative lymphocytes in interstitial tissue.ConclusionEBV infection is not associated with the occurrence of rectal cancer.

rectal neoplasms; simplexvirus; in situ hybridization

2013-08-31;

2014-04-25

闫海龙(1986-)，男，硕士研究生。

张建立(1965-)，男，博士，主任医师，硕士生导师。

R735.37

A

1008-0341(2014)03-0202-03