瑞香狼毒对健康人体外外周血淋巴细胞微核率的影响

张三润等

[摘要] 目的 初步探讨瑞香狼毒对健康年轻人体外外周血淋巴细胞内染色体畸变的影响效应。 方法 在外周血培养过程中加入不同剂量的瑞香狼毒水煎液，显微镜下检测微核率的变化，通过x2检验作统计学分析。 结果 瑞香狼毒终浓度为2.5、5、10mg/mL实验组的微核出现率分别是1.63‰、5.13‰和7.25‰，对照组微核率为1.50‰，第1个低剂量实验组微核率与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。后两个中剂量和高剂量实验组微核率显著高于对照组，并具有统计学差异（P<0.01）。 结论 超过一定剂量的瑞香狼毒水煎液可能对健康人体外外周血淋巴细胞遗传物质有不同程度的毒性作用。

[关键词] 瑞香狼毒；淋巴细胞；微核

[中图分类号] Q464 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）16-40-03

Effects of Stellera chamaejasme L. on the health of human lymphocyte micronucleus rate of peripheral blood

ZHANG Sanrun ZHOU Haole ZHENG Mingxia BUREN Qiqige WANG Jinfeng ZHANG Dongze HAO Xingxia

Department of Genetics， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010059， China

[Abstract] Objective To discuss toxicity effect of Stellera chamaejasme L.on lymphocyte chromosome in healthy young human peripheral blood. Methods Stellera chamaejasme L.water decoction with different doses was added to the peripheral blood lymphocyte culture fluid， then micronucleus rates were detected under the microscope. The significance tests were conducted by x2 test method. Results The micronucleus rates of the experimental groups in stellera chamaejasme L. exposure concentration of 2.5， 5， 10mg/ml were 1.63‰， 5.13‰ and 7.25‰. The micronucleus rate of control group was 1.50‰. The micronucleus rate of the first low dose experimental group compared with the control group no significant difference（P>0.05）. The micronucleus rates of middle and high doses of the experimental groups were significantly higher than that of control group （P<0.01）. Conclusion Stellera chamaejasme L. of above a certain dose may exert different degree of damage to genetic material on the health of human peripheral blood lymphocytes.

[Key words] Stellera chamaejasme L.； Lymphocyte； Micronucleus

瑞香狼毒属于瑞香科，是多年生草本植物，具有软坚散结、去痛、止咳祛痰、抗菌和抗病毒等多种药效，可作为一种理想的天然药物进行开发。近年来的研究发现，狼毒提取物对肿瘤细胞有较强的抑制活性，例如，肺癌、食管癌、肝癌等恶性肿瘤的治疗，已广泛应用于我国民间[1]，国内外很多学者也报道，瑞香狼毒的各种提取物或分离出来的某种单一成分均具有显著的抗肿瘤作用，通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞周期等机制而起到抗肿瘤功效[2-8]。但关于瑞香狼毒在治疗疾病过程中，对人体是否有毒副作用方面的报道较少，本文就瑞香狼毒对人外体外周血淋巴细胞染色体毒性进行了初步研究，报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

观察微核所用的BK5000生物显微镜由重庆奥

特光学仪器有限责任公司生产；1640混合培养基由北京易世盛达科技发展有限公司提供。

1.2 血样

外周血由内蒙古医科大学8位健康大学生提供，男4例，女4例，平均年龄21岁。他们均具有良好的生活习惯，不抽烟不喝酒，没有接触过能引起染色体畸变的诱变剂以及其他不良环境因素，均无染色体病家族史。

1.3 药品

瑞香狼毒购自包头市医药有限责任公司，取瑞香狼毒生药片10g，加蒸馏水100mL，煮沸后文火煎15min，滤去药渣后，加蒸馏水至100mL，高压灭菌后作为原液放入冰箱中备用。

1.4 实验分组

上述每位大学生被抽取的外周血分为两份，一份用于染毒实验组，另一份用于对照实验组。染毒

注：与对照组比较，*P<0.01endprint

实验组培养3瓶，每瓶培养液在加入外周血的同时分别加入不同浓度的瑞香狼毒水煎液0.5mL，使3瓶培养液中瑞香狼毒的终浓度分别为2.5、5、10mg/mL。对照实验组培养1瓶，培养时在加入外周血的同时加入0.5mL生理盐水。

1.5 微核观察和数据分析

微核标本的制备与检测方法参考Chang等[9]的方法进行。每瓶培养液制作的微核标本在显微镜下观察1000个胞浆完整的淋巴细胞。在这1000个细胞中，如果看到与细胞核颜色一样，并且位于细胞核附近游离的圆形或椭圆形小核（小于细胞核1/3）的细胞计为1个微核细胞，用千分率（‰）表示微核率。微核观察数据用x2检验方法进行统计分析。

2 结果

3 讨论

微核是由染色体数目或结构畸变导致的。在有丝分裂过程中，如果细胞受到某些环境因子的刺激会引起染色体发生断裂，形成无着丝粒的短片，或导致纺锤丝断裂，使整条染色体失去纺锤丝的牵引作用，上述无着丝粒的短片或失去纺锤丝的整条染色体，在分裂末期不能参与子细胞核的形成，而形成了位于子核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，这些核块便浓缩成主核之外的独立小核，即微核。所以，在间期细胞中的微核是染色体畸变的结果，它是染色体畸变后所表现出来的一种形式，它在细胞中的出现频率一般与染色体畸变率呈正相关[10]。大量研究结果表明，随着环境中诱变剂剂量的增加或辐射的不断累积微核的出现率会随之增高。所以，现在国内外很多学者以微核率为指标来检测染色体畸变程度。例如，一些食品添加剂、某些化学试剂、某些新药以及其他环境因素是否具有遗传毒性效应均可利用检测微核率的简易手段进行有效的评价。国内外学者运用不同的研究方法，以不同的指标检测了狼毒的毒性作用。刘萍等[11]报道狼毒大载水提物在较高剂量下对小鼠有致突变作用，但在低剂量下无明显毒性。杨珺等[12]研究表明：用瑞香狼毒提取液干预，结果对大鼠原代培养的肺成纤维细胞的增殖有比较明显的抑制效应，并且随着瑞香狼毒提取液剂量的增加而这种抑制效应也随着加强。同时当瑞香狼毒提取液超过一定剂量时表现出一定的细胞毒性作用。本实验结果表明，外周血淋巴细胞培养液中瑞香狼毒终浓度为2.5mg/mL时未检测到微核率的显著变化，说明低剂量的瑞香狼毒可能不会引起遗传损伤；而中剂量（5mg/mL）和高剂量（10mg/mL）的瑞香狼毒可使健康人体外淋巴细胞微核率明显增高，说明超过一定剂量的瑞香狼毒水煎液可能对人体染色体有致损伤作用，其损伤机理是引起染色体断裂还是染色体不分离还有待于进一步研究。我们知道，染色体即使是微小片段的改变也会累及到很多基因，与致癌、致畸以及其他疾病的发生有着密切的联系。所以，狼毒虽然有抗肿瘤等治疗多种疾病的功效，但不能忽视对人体可能具有的潜在的遗传毒性作用。

[参考文献]

[1] 潘国凤，杨庆，翁小刚，等.瑞香狼毒抗肿瘤作用机制研究进展[J].中华中医药杂志，2007，22（12）：873.

[2] 王敏，贾正平，马骏，等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志，2005，30（8）：603.

[3] 邢立强，李旺，孙黎，等.瑞香狼毒提取物逆转肺癌细胞耐药的免疫组化研究[J].陕西中医，2007，28（4）：500.

[4] 杨柯，张京玲，黄谦，等.狼毒水提液对人A549肺癌细胞凋亡的影响[J].实用中西医结合临床，2011，11（5）：88.

[5] 刘晓霓，李玉洁，杨庆，等.瑞香狼毒醇提物体外抗肿瘤作用研究[J].中国中药杂志，2010，35（22）：3048-3051.

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[6] 李鸿君，邢立强，李旺，等.瑞香狼毒水提取物对肺腺癌细胞株耐药及凋亡的影响[J].河北医药，2013，35（6）：823-825.

[7] 潘国凤，杨庆，刘安，等.瑞香狼毒药效组分抑制小鼠皮下移植瘤H22的实验研究[J].中华中医药杂志，2009，24（4）：438-442.

[8] 王义善，郑秋生，贾喜凤，等.狼毒抑制降低癌细胞恶性表型小鼠体内转移及彗星电泳实验研究[J].中医杂志，2006，47（增刊）：148-149.

[9] Chang WP，Tsai MS，Hwang JS，et al. Follow-up in the micronucleus frequencies and its subsets in human population with chronic lowdose gamma-irradiation exposure[J].Mutat Res，1999，428（1-2）：99-105.

[10] 杨茜，杜金茹，栗淑媛，等.錳中毒患者外周血淋巴细胞微核率的观察[J].化工劳动保护（工业卫生与职业病分册），1995，16（3）：110-111.

[11] 刘萍，杜娟，于丽华，等.大戟水提物对小鼠致突变作用的实验研究[J].山东医科大学学报，2000，38（1）：27，31.

[12] 杨珺，王世岭，吴坤，等.瑞香狼毒提取液对大鼠肺成纤维细胞增殖的抑制与其细胞毒性作用[J].中国临床康复，2005，9（31）：139-141.

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实验组培养3瓶，每瓶培养液在加入外周血的同时分别加入不同浓度的瑞香狼毒水煎液0.5mL，使3瓶培养液中瑞香狼毒的终浓度分别为2.5、5、10mg/mL。对照实验组培养1瓶，培养时在加入外周血的同时加入0.5mL生理盐水。

1.5 微核观察和数据分析

微核标本的制备与检测方法参考Chang等[9]的方法进行。每瓶培养液制作的微核标本在显微镜下观察1000个胞浆完整的淋巴细胞。在这1000个细胞中，如果看到与细胞核颜色一样，并且位于细胞核附近游离的圆形或椭圆形小核（小于细胞核1/3）的细胞计为1个微核细胞，用千分率（‰）表示微核率。微核观察数据用x2检验方法进行统计分析。

2 结果

3 讨论

微核是由染色体数目或结构畸变导致的。在有丝分裂过程中，如果细胞受到某些环境因子的刺激会引起染色体发生断裂，形成无着丝粒的短片，或导致纺锤丝断裂，使整条染色体失去纺锤丝的牵引作用，上述无着丝粒的短片或失去纺锤丝的整条染色体，在分裂末期不能参与子细胞核的形成，而形成了位于子核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，这些核块便浓缩成主核之外的独立小核，即微核。所以，在间期细胞中的微核是染色体畸变的结果，它是染色体畸变后所表现出来的一种形式，它在细胞中的出现频率一般与染色体畸变率呈正相关[10]。大量研究结果表明，随着环境中诱变剂剂量的增加或辐射的不断累积微核的出现率会随之增高。所以，现在国内外很多学者以微核率为指标来检测染色体畸变程度。例如，一些食品添加剂、某些化学试剂、某些新药以及其他环境因素是否具有遗传毒性效应均可利用检测微核率的简易手段进行有效的评价。国内外学者运用不同的研究方法，以不同的指标检测了狼毒的毒性作用。刘萍等[11]报道狼毒大载水提物在较高剂量下对小鼠有致突变作用，但在低剂量下无明显毒性。杨珺等[12]研究表明：用瑞香狼毒提取液干预，结果对大鼠原代培养的肺成纤维细胞的增殖有比较明显的抑制效应，并且随着瑞香狼毒提取液剂量的增加而这种抑制效应也随着加强。同时当瑞香狼毒提取液超过一定剂量时表现出一定的细胞毒性作用。本实验结果表明，外周血淋巴细胞培养液中瑞香狼毒终浓度为2.5mg/mL时未检测到微核率的显著变化，说明低剂量的瑞香狼毒可能不会引起遗传损伤；而中剂量（5mg/mL）和高剂量（10mg/mL）的瑞香狼毒可使健康人体外淋巴细胞微核率明显增高，说明超过一定剂量的瑞香狼毒水煎液可能对人体染色体有致损伤作用，其损伤机理是引起染色体断裂还是染色体不分离还有待于进一步研究。我们知道，染色体即使是微小片段的改变也会累及到很多基因，与致癌、致畸以及其他疾病的发生有着密切的联系。所以，狼毒虽然有抗肿瘤等治疗多种疾病的功效，但不能忽视对人体可能具有的潜在的遗传毒性作用。

[参考文献]

[1] 潘国凤，杨庆，翁小刚，等.瑞香狼毒抗肿瘤作用机制研究进展[J].中华中医药杂志，2007，22（12）：873.

[2] 王敏，贾正平，马骏，等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志，2005，30（8）：603.

[3] 邢立强，李旺，孙黎，等.瑞香狼毒提取物逆转肺癌细胞耐药的免疫组化研究[J].陕西中医，2007，28（4）：500.

[4] 杨柯，张京玲，黄谦，等.狼毒水提液对人A549肺癌细胞凋亡的影响[J].实用中西医结合临床，2011，11（5）：88.

[5] 刘晓霓，李玉洁，杨庆，等.瑞香狼毒醇提物体外抗肿瘤作用研究[J].中国中药杂志，2010，35（22）：3048-3051.

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[6] 李鸿君，邢立强，李旺，等.瑞香狼毒水提取物对肺腺癌细胞株耐药及凋亡的影响[J].河北医药，2013，35（6）：823-825.

[7] 潘国凤，杨庆，刘安，等.瑞香狼毒药效组分抑制小鼠皮下移植瘤H22的实验研究[J].中华中医药杂志，2009，24（4）：438-442.

[8] 王义善，郑秋生，贾喜凤，等.狼毒抑制降低癌细胞恶性表型小鼠体内转移及彗星电泳实验研究[J].中医杂志，2006，47（增刊）：148-149.

[9] Chang WP，Tsai MS，Hwang JS，et al. Follow-up in the micronucleus frequencies and its subsets in human population with chronic lowdose gamma-irradiation exposure[J].Mutat Res，1999，428（1-2）：99-105.

[10] 杨茜，杜金茹，栗淑媛，等.錳中毒患者外周血淋巴细胞微核率的观察[J].化工劳动保护（工业卫生与职业病分册），1995，16（3）：110-111.

[11] 刘萍，杜娟，于丽华，等.大戟水提物对小鼠致突变作用的实验研究[J].山东医科大学学报，2000，38（1）：27，31.

[12] 杨珺，王世岭，吴坤，等.瑞香狼毒提取液对大鼠肺成纤维细胞增殖的抑制与其细胞毒性作用[J].中国临床康复，2005，9（31）：139-141.

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实验组培养3瓶，每瓶培养液在加入外周血的同时分别加入不同浓度的瑞香狼毒水煎液0.5mL，使3瓶培养液中瑞香狼毒的终浓度分别为2.5、5、10mg/mL。对照实验组培养1瓶，培养时在加入外周血的同时加入0.5mL生理盐水。

1.5 微核观察和数据分析

微核标本的制备与检测方法参考Chang等[9]的方法进行。每瓶培养液制作的微核标本在显微镜下观察1000个胞浆完整的淋巴细胞。在这1000个细胞中，如果看到与细胞核颜色一样，并且位于细胞核附近游离的圆形或椭圆形小核（小于细胞核1/3）的细胞计为1个微核细胞，用千分率（‰）表示微核率。微核观察数据用x2检验方法进行统计分析。

2 结果

3 讨论

微核是由染色体数目或结构畸变导致的。在有丝分裂过程中，如果细胞受到某些环境因子的刺激会引起染色体发生断裂，形成无着丝粒的短片，或导致纺锤丝断裂，使整条染色体失去纺锤丝的牵引作用，上述无着丝粒的短片或失去纺锤丝的整条染色体，在分裂末期不能参与子细胞核的形成，而形成了位于子核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，这些核块便浓缩成主核之外的独立小核，即微核。所以，在间期细胞中的微核是染色体畸变的结果，它是染色体畸变后所表现出来的一种形式，它在细胞中的出现频率一般与染色体畸变率呈正相关[10]。大量研究结果表明，随着环境中诱变剂剂量的增加或辐射的不断累积微核的出现率会随之增高。所以，现在国内外很多学者以微核率为指标来检测染色体畸变程度。例如，一些食品添加剂、某些化学试剂、某些新药以及其他环境因素是否具有遗传毒性效应均可利用检测微核率的简易手段进行有效的评价。国内外学者运用不同的研究方法，以不同的指标检测了狼毒的毒性作用。刘萍等[11]报道狼毒大载水提物在较高剂量下对小鼠有致突变作用，但在低剂量下无明显毒性。杨珺等[12]研究表明：用瑞香狼毒提取液干预，结果对大鼠原代培养的肺成纤维细胞的增殖有比较明显的抑制效应，并且随着瑞香狼毒提取液剂量的增加而这种抑制效应也随着加强。同时当瑞香狼毒提取液超过一定剂量时表现出一定的细胞毒性作用。本实验结果表明，外周血淋巴细胞培养液中瑞香狼毒终浓度为2.5mg/mL时未检测到微核率的显著变化，说明低剂量的瑞香狼毒可能不会引起遗传损伤；而中剂量（5mg/mL）和高剂量（10mg/mL）的瑞香狼毒可使健康人体外淋巴细胞微核率明显增高，说明超过一定剂量的瑞香狼毒水煎液可能对人体染色体有致损伤作用，其损伤机理是引起染色体断裂还是染色体不分离还有待于进一步研究。我们知道，染色体即使是微小片段的改变也会累及到很多基因，与致癌、致畸以及其他疾病的发生有着密切的联系。所以，狼毒虽然有抗肿瘤等治疗多种疾病的功效，但不能忽视对人体可能具有的潜在的遗传毒性作用。

[参考文献]

[1] 潘国凤，杨庆，翁小刚，等.瑞香狼毒抗肿瘤作用机制研究进展[J].中华中医药杂志，2007，22（12）：873.

[2] 王敏，贾正平，马骏，等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志，2005，30（8）：603.

[3] 邢立强，李旺，孙黎，等.瑞香狼毒提取物逆转肺癌细胞耐药的免疫组化研究[J].陕西中医，2007，28（4）：500.

[4] 杨柯，张京玲，黄谦，等.狼毒水提液对人A549肺癌细胞凋亡的影响[J].实用中西医结合临床，2011，11（5）：88.

[5] 刘晓霓，李玉洁，杨庆，等.瑞香狼毒醇提物体外抗肿瘤作用研究[J].中国中药杂志，2010，35（22）：3048-3051.

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[6] 李鸿君，邢立强，李旺，等.瑞香狼毒水提取物对肺腺癌细胞株耐药及凋亡的影响[J].河北医药，2013，35（6）：823-825.

[7] 潘国凤，杨庆，刘安，等.瑞香狼毒药效组分抑制小鼠皮下移植瘤H22的实验研究[J].中华中医药杂志，2009，24（4）：438-442.

[8] 王义善，郑秋生，贾喜凤，等.狼毒抑制降低癌细胞恶性表型小鼠体内转移及彗星电泳实验研究[J].中医杂志，2006，47（增刊）：148-149.

[9] Chang WP，Tsai MS，Hwang JS，et al. Follow-up in the micronucleus frequencies and its subsets in human population with chronic lowdose gamma-irradiation exposure[J].Mutat Res，1999，428（1-2）：99-105.

[10] 杨茜，杜金茹，栗淑媛，等.錳中毒患者外周血淋巴细胞微核率的观察[J].化工劳动保护（工业卫生与职业病分册），1995，16（3）：110-111.

[11] 刘萍，杜娟，于丽华，等.大戟水提物对小鼠致突变作用的实验研究[J].山东医科大学学报，2000，38（1）：27，31.

[12] 杨珺，王世岭，吴坤，等.瑞香狼毒提取液对大鼠肺成纤维细胞增殖的抑制与其细胞毒性作用[J].中国临床康复，2005，9（31）：139-141.

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