顺铂对耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30生物学功能的影响

刘文娟 宫玉典

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，其致死率为癌症总致死率的5%，严重威胁女性健康[1]。目前，卵巢癌的主要治疗方法为化疗，使用的一线药物有紫杉醇，铂类等[2]。研究显示卵巢癌患者对紫杉醇及铂类药物治疗有较好的反应性，使用之初可明显抑制或缓解，但患者在持续治疗之后病情会恶化或复发，从而导致死亡。持续使用药物一段时间患者的病情加重与肿瘤细胞的耐药性相关，肿瘤细胞对这些化学治疗药物耐受，这些化学治疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用下降或消失，最终导致患者应药物耐受而死亡。顺铂是治疗卵巢癌的重要化疗药，本研究使用耐紫杉醇的卵巢癌细胞SKOV3-TR30为研究对象，观察顺铂对其生物学功能的影响，探讨SKOV3-TR30耐顺铂的主要机制，为SKOV3-TR30耐药性的逆转提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 材料 人卵巢上皮细胞癌细胞株SKVO3购自美国模式菌种收集中心（ATCC），使用中等剂量间隙结合低剂量维持的方法诱导建立SKOV3-TR30，使用含紫杉醇的McCOY’5A培养基对SKOV3-TR30进行培养传代，使用时将SKOV3-TR30用不含紫杉醇的McCOY’5A培养基培养3周。顺铂购自山东齐鲁制药有限公司，MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氮唑溴盐)，细胞周期试剂盒和凋亡试剂盒均购于森贝伽（南京）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞周期检测将SKOV3及SKOV3-TR30细胞接种6孔板，保持每孔细胞数4×105/ml，37℃，5%CO2培养24h后换液，分别加入顺铂浓度为25.65、56.82μmol/L（此浓度为该细胞药物的半抑制浓度）的培养液培养48h，使用细胞周期试剂盒进行细胞周期检测。

1.2.2 细胞凋亡率检测 将SKOV3及SKOV3-TR30细胞接种 96 孔板，5%CO2培养 12、24、36、48h后换液，分别加入顺铂浓度为25.65、56.82μmol/L（此浓度为该细胞药物的半抑制浓度）的培养液培养24h，之后加入MTT每孔20μl，37℃、5%CO2培养4h，每孔加入DMSO 200μl，使用酶标仪测定波长540nm处每孔吸光度。细胞凋亡率=（加药细胞吸光度-对照细胞吸光度）/对照细胞吸光度×100%。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（)表示，使用方差分析（Oneway ANOVA)分析各组组间差异，计数资料的组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂对SKOV3，SKOV3-TR30细胞周期的影响 图1、图2为流式细胞法检测细胞周期结果，结果显示未加药时SKOV3，SKOV3-TR30主要分布与G0/G1期，两者细胞数比较差异无统计学意义，顺铂处理48h后，各加药细胞与其未加药的细胞比较G0/G1期细胞均减少，且与未加药细胞比较，细胞数差异有统计学意义（P＜0.05），但SKOV3的减少幅度大于SKOV3-TR30（P＜0.05），两者均停留于G2/M期，且SKOV3 滞留于G2/M期细胞的增加幅度大于SKOV3-TR30（P＜0.05）。

图1 未加药细胞周期测定结果

图2 加药后细胞周期测定结果

2.2 顺铂对SKOV3，SKOV3-TR30细胞凋亡的影响表1为顺铂对SKOV3、SKOV3-TR30细胞凋亡的影响，结果显示，顺铂作用 0、12h时，SKOV3、SKOV3-TR30 细胞凋亡差异无统计学意义，顺铂作用 24、36、48h，SKOV3、SKOV3-TR30细胞凋亡与之前相比明显增多（P＜0.05），且SKOV3凋亡细胞比例明显高于SKOV3-TR30，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 顺铂对SKOV3，SKOV3-TR30 细胞凋亡的影响（%，）

表1 顺铂对SKOV3，SKOV3-TR30 细胞凋亡的影响（%，）

注：与0h比较，aP＜0.05,与同时间点SKOV3-TR30比较，bP＜0.05

时间 SKOV3 SKOV3-TR30 0h 8.47±2.15 8.16±2.27 12h 20.48±2.36 21.85±2.41 24h 48.57±4.29ab 31.62±4.72a 36h 64.28±4.67ab 41.91±5.71a 48h 87.26±6.27ab 54.62±6.19a

3 讨论

SKOV3-TR30为耐紫杉醇的人卵巢上皮细胞癌细胞株。已有研究认为肿瘤细胞耐紫杉醇的记住主要如下，细胞膜上存在转运蛋白如P-gp，这些蛋白将细胞中的药物转运至细胞外，从而降低药物在细胞中的浓度；肿瘤细胞微管的异常，如微管蛋白突变等[3]；药物作用靶点的改变，从而导致药物起作用的细胞信号通路改变[4]；紫杉醇耐药相关基因表达的异常[5]。

本研究中顺铂处理48h后，SKOV3、SKOV3-TR30加药细胞与未加药的细胞比较G0/G1期细胞均减少，且SKOV3的减少幅度大于SKOV3-TR30，说明顺铂均可影响SKOV3、SKOV3-TR30细胞的周期，且对SKOV3的影响大于SKOV3-TR30。顺铂作用 24、36、48h，SKOV3、SKOV3-TR30细胞凋亡与之前相比明显增多，且SKOV3凋亡细胞比例明显高于SKOV3-TR30，说明随着顺铂作用时间的延长，其对SKOV3和SKOV3-TR30细胞凋亡的影响越大，且对SKOV3细胞的凋亡作用大于SKOV3-TR30细胞。本研究结果显示SKOV3-TR30对顺铂存在一定耐药性，这可能是由于细胞的多药耐药引起。

[1]林淑君,许慎,蔡友鹏.洛铂联合化疗治疗复发性卵巢癌的临床观察[J].当代医学,2011,17(6):65.

[2]张瑞平,董霖.卵巢癌患者应用紫衫醇联合卡铂方案的观察和护理[J].当代医学,2010,16(7):108-109.

[3]Xia W,Low PS.Folate-targeted therapies for cancer[J].J Med Chem,2010,53（19）:6811-6824.

[4]石云,段振玲,徐琳,等.顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬和凋亡的研究[J].现代妇产科进展,2011,20（1）:45-47.

[5]段爱红,王辉,陈俊丽.洛铂诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡的研究[J].中国热带医学,2009,9(7):1214-1215.