大鼠肝癌免疫微环境中Treg与IL-10水平的变化及意义

张志强 贺杰峰 张瑜 兰志伟 赵浩亮

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居全球恶性肿瘤的第5位[1]。肝癌免疫治疗是目前研究的热点，但肝癌存在着严重的肿瘤免疫微环境抑制，从而影响了肝癌免疫治疗的效果[2]。实验动物肝癌模型的免疫微环境分析目前在国内罕见报道，本研究通过建立诱导性大鼠肝癌模型，并分析肝癌局部免疫微环境中免疫细胞以及因子水平的变化及意义，为进一步改善肝癌免疫微环境、加强免疫治疗的效果研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 Wistar雄性大鼠 40只，体重180～220g，购自山西医科大学动物实验中心，在室内标准规定条件下饲养，室温20℃，每笼10只。二乙基亚硝胺（DEN）购自

美国Sigma公司。FITC-CD4单抗、PE-CD25单抗及同型对照FITC-IgG2b单抗、PE-IgG1单抗均购自美国BD公司。兔抗鼠IL-10、Treg多抗和SABC免疫组化试剂盒均购自北京博奥森公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分组 大鼠正常喂养1周后随机分为三组：肝癌模型组（20只）、生理盐水组（10只）、空白对照组（10只）。肝癌模型组：大鼠按100mg/kg给予DEN腹腔注射，1次/周。生理盐水组（10只）：按腹腔注射同比例生理盐水，1次/周。空白对照组（10只）：大鼠不做任何处理。实验期间正常饮食饮水。

1.2.2 流式细胞术(FCM)检测 Treg的数量比例：分别制备大鼠肝癌模型组癌组织、生理盐水组肝组织、空白对照组肝组织单个核细胞悬液 (1×107／ml)，取100μl细胞悬液，加入FITC-CD4单抗和 PE-CD25单抗，同时设同型抗体对照组(即加入等量的FITC-IgG2b单抗和PE-IgG1单抗)，以排除非特异性染色影响，避光放置20min。用FACSCalibur流式细胞仪检测CD4、CD25的表达。

1.2.3 采用免疫组化SABC三步法检测肝组织Treg和IL-10的表达 所有新鲜标本均经10%甲醛固定，24 h内取材，石蜡包埋，连续切片，片厚2μm。一抗工作浓度为1∶150，以PBS代替两种一抗做阴性对照。枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0)下微波修复抗原。其余步骤严格按说明书操作。Treg和 IL-10阳性细胞的着色主要表达在细胞浆和细胞膜。采用Mias-2000图像分析系统分析结果:每张切片任意选取10个区域，在400倍物镜下测定阳性物质平均灰度值，灰度值与物质表达水平成反比。

1.3 统计学方法 用SPSS17.0软件处理分析，实验数据用（）表示，组间均数比较用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠肝癌模型的建立 肝癌模型组的16只Wistar大鼠成功建立肝癌模型（图1为大鼠肝癌组织），实验过程中大鼠的死亡率为20%。肝癌模型组实验过程中大鼠毛发凌乱，无光泽，食欲差，精神萎靡，活动少，对外界刺激反应慢。病理检查显示肝癌组大鼠诱导4周可见肝内有假小叶形成，假小叶内可见纤维再分隔现象。7周后癌变肝组织可见癌巢形成，癌细胞具有多形性和明显异型性呈多角型，核大，核仁明显，并可见多核巨细胞（图2为肝癌癌细胞免疫组化染色）。

2.2 大鼠肝组织CD4+CD25+Treg百分率 肝癌模型组CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞百分率(14.32±4.84)%，较生理盐水组(7.95±3.55)%和空白对照组(5.64±6.10)%显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 肝组织中Treg的比较（）

表1 肝组织中Treg的比较（）

注：与空白对照组比较，aP<0.05; 与生理盐水组比较，bP<0.05

组别 例数 CD4+CD25+Treg细胞（%）空白对照组 10 5.64±6.10生理盐水组 10 7.95±3.55肝癌模型组 20 14.32±4.84ab

2.3 大鼠肝组织中Treg和IL-10水平 肝癌模型组癌组织中Treg和IL-10表达水平显著高于空白对照组和生理盐水组，差异具有统计学意义(P＜0.05)（图3和图4分别为Treg细胞和IL-10免疫组化染色），见表2。

表2 肝组织中Treg、IL-10表达水平（灰度值，）

表2 肝组织中Treg、IL-10表达水平（灰度值，）

注：与空白对照组比较，aP<0.05,bP<0.01;与生理盐水组比较，cP<0.05,dP<0.05

组别 例数 Treg IL-10空白对照组 10 150.6±1.6 168.8±3.5生理盐水组 10 142.5±3.7c 157.6±4.3d肝癌模型组 20 118.4±2.4a 127.4±11.2b

2.4 Treg与IL-10的相关性分析 用SPSS软件以Pearson相关分析法分析肝癌组织中Treg与IL-10表达水平的相关性，肝癌组织中Treg与IL-10表达水平变化的相关系数为0.567，P＜0.05。Treg与IL-10的表达水平呈明显正相关。

3 讨论

肝癌动物模型是研究肝癌发生发展机制和免疫治疗的重要材料[3]。本研究对大鼠肝癌模型的制作进行了改进，通过比较发现建立的此肝癌模型微环境中Treg和IL-10水平变化趋势与人类肝癌中的变化相似[4-5]，表明本研究建立的大鼠肝癌模型能够模拟人类肝癌的免疫微环境，为下一步研究改善肝癌免疫微环境提供了合适的动物模型。

肝癌局部免疫微环境是由肝癌细胞和其周围淋巴细胞、免疫细胞、肿瘤血管和淋巴管结构的组成细胞等成分构成，经典的肝小叶结构和这些细胞群以及它们释放的物质共同组成了肝脏的微环境[6]。肝癌微环境中的主要成分是一些免疫相关细胞和因子，它们贯穿于肿瘤发展的整个过程，对肿瘤产生了重大的影响[7]。Treg是一类具有免疫负性调控作用的免疫细胞，它对肝癌免疫微环境抑制和耐受起着关键作用[8]。研究表明，多种肿瘤患者的外周血和肿瘤局部的Treg增加，提示Treg在肿瘤微环境中能够减弱免疫细胞功能，导致肿瘤的免疫逃逸，促使肿瘤进展[9]。但Treg在大鼠肝癌模型免疫微环境中的数量和功能尚未见报道。本研究显示，大鼠肝癌组微环境中Treg较对照组明显增加，提示大鼠机体免疫功能处于抑制状态，从而能够促进肝癌发生发展。IL-10主要由Th2细胞、单核细胞和肿瘤细胞产生，与TGF-β1共同作用通过抑制一氧化氮(NO)的产生而干扰IFN-r对巨噬细胞的活化[10]。本研究显示肝癌组中IL-10较对照组明显增加，可能是由于大鼠细胞免疫功能减弱，导致细胞因子调节紊乱，从而使微环境中IL-10水平升高。

Treg通过分泌IL-10等因子起免疫调节作用[11]。本研究发现，肝癌微环境中Treg和IL-10表达水平明显增加，而两者的表达呈正相关，表明Treg能分泌IL-10，而IL-10能够进一步诱导Treg分化，使机体免疫功能低下或受到抑制，导致肿瘤细胞能够逃避免疫监督，从而促进肿瘤的生长和转移。这也为以后肝癌免疫治疗的研究提供了新的途径。

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