牛乳金黄色葡萄球菌分离株超抗原肠毒素基因分型研究

孙 颖，汤婷婷，鲍庆晗，郭海勇＊，崔京春

（1.吉林师范大学生命科学学院，吉林四平136000；2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人及动物感染的重要病原菌之一，其中产超抗原毒素的葡萄球菌具有极强的致病性，引起人毒素性休克症、化脓症等多种疾病，尤其是耐药菌株（MRSA）绝大部分可产生超抗原毒素，交叉污染传播而又难以治疗，对人类健康造成了严重威胁；引起奶牛、羊的乳腺炎，给养殖业带来了重大经济损失［1］。金黄色葡萄球菌能产生多种毒素，主要包括肠毒素（enterotoxins，SEs）、休克综合征毒素－1（toxic－shock syndrome toxin－1，TSST－1）、剥落毒素（exfoliative toxins，ETs）和杀白细胞素（panton－valentine leukocidin，PVL），其中肠毒素是引起多种疾病及食物中毒的主要因子［2－3］。根据生物学特性和基因结构相关性解析，目前已发现了SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG－I及 SER－T 11 种 肠 毒 素，SE1J－Q、SE1U－X12种肠毒素类似毒素和毒性休克综合征毒素1 （TSST－1）等24种葡萄球菌超抗原毒素［4－7］。国内外有较多奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌毒素基因流行情况的调查研究，从患乳腺炎奶牛乳样中分离的金黄色葡萄球菌近80%产生超抗原毒素，但不同地区分离株所含超抗原毒素基因型不同，本研究根据金黄色葡萄球菌肠毒素基因（sea～see）、中毒性休克综合征毒素基因（tst）及femA、femB基因设计合成引物进行PCR扩增，检测四平地区某牛场患病牛乳金黄色葡萄球菌分离株毒素基因分型情况，对不同地区和来源的金黄色葡萄球菌菌株之间关系及分子流行病学的研究提供科学的理论依据，对及时有效控制金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌标准株（ATCC12600）由大连吉翔农业科技有限公司研究中心保藏提供；金黄色葡萄球菌834株（阳性对照）由日本北里大学胡东良教授惠赠；金黄色葡萄球菌分离株SP－3从患奶牛乳腺炎的乳样中分离，由吉林师范大学微生物实验室保存。

1.1.2 试 剂 DNA Marker、ExTaq 聚 合 酶、dNTP、琼脂糖等试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司；柱式基因组DNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；EDTA、Tris－base等购自北京鼎国生物技术公司；其他生化试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.1.3 仪器设备 MCV－131BNF 超净台为日本SANYO公司产品；SIGMA 1－14冷冻台式离心机为Sigma公司产品；UV－1240紫外分光光度计为日本岛津公司产品；全自动数码凝胶成像分析系统为BIO－RAD公司产品；MG25＋PCR扩增仪为杭州朗基公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计合成 参照 Omoe等［8］报道设计合成金黄色葡萄球菌SEA－SEE及TSST－1等6种超抗原毒素基因及金黄色葡萄球菌特异基因femA和femB的PCR扩增引物（表1），引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 金黄色葡萄球菌超抗原特异引物序列及扩增片段Table 1 Sequences and sizes of staphylococcal superantigen－specific primers

1.2.2 金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取及纯度分析 取4℃保存的3株金黄色葡萄球菌斜面分别划线接种到卵黄甘露醇高盐琼脂平板上，37℃培养24h，选取单菌落接种至胰胨大豆胨肉汤培养基中，37℃摇床培养20h，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取各菌株的基因组DNA。用紫外分光光度计分别测定DNA稀释溶液在波长260nm和280nm处的吸光度值，计算OD260／OD280的平均值。

1.2.3 金黄色葡萄球菌femA、femB基因及毒素基因的PCR扩增 以金黄色葡萄球菌标准株（ATCC12600）、金黄色葡萄球菌834株及金黄色葡萄球菌分离株基因组DNA为模板，进行金黄色葡萄球菌各型肠毒素基因PCR扩增，同时设置以灭菌水为模板的阴性对照组。反应体系为50μL，DNA模板2μL，Mg2＋（25mmol／L）4μL，dNTP（各2.5 mmol／L）4μL，上游引物（10μmol／L）2μL，下游引物（10μmol／L）2μL，TaqDNA 聚合酶（0.5U）0.5 μL，10× ExTaqbuffer 5μL，无菌水补至50μL。反应条件：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60 s，30个循环；72℃10min。PCR 产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌基因组DNA的纯度分析

将提取的各菌株基因组DNA适当稀释后分别用紫外分光光度计测各菌株基因组DNA样品的OD260、OD280，经计算各基因组DNA的OD260／OD280的平均值均在1.825～1.848之间，表明提取的总DNA纯度较高，没有蛋白和RNA的污染。

2.2 金黄色葡萄球菌分离株femA、femB基因PCR扩增结果

以金黄色葡萄球菌标准株（ATCC12600）、834株及SP－3分离株的基因组DNA为模板，进行femA、femB基因的PCR扩增，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1A和图1B。femA和femB基因是金黄色葡萄球菌染色体固有基因，是其特异的表达基因且高度保守。从图1可以看出，金黄色葡萄球菌对照株和分离株均扩增出大小为134bp的femA特征带和大小为651bp的femB特征带，灭菌水阴性对照组无条带出现，因此SP－3分离株可鉴定为金黄色葡萄球菌。

2.3 金黄色葡萄球菌分离株超抗原肠毒素基因检测结果

以SP－3分离株的DNA为模板，分别加入SEA－SEE、TST各组PCR引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。金黄色葡萄球菌对照菌株和SP－3分离株经PCR扩增，凝胶电泳分析其携带超抗原毒素基因型结果见表2［8－9］。由电泳结果分析，金黄色葡萄球菌标准株ATCC12600和阴性对照组均无扩增出特征条带，不携带超抗原毒素基因。而携带sec（271 bp）、tst－1（447bp）基因的金黄色葡萄球菌834株均出现清晰的阳性条带，并且各条带大小与实际相符。金黄色葡萄球菌SP－3分离株携带多种超抗原肠毒素基因，共检出sea、sec、sed和tst－1 4种超抗原肠毒素基因。

图1 金黄色葡萄球菌femA、femB基因PCR扩增Fig.1 PCR amplication of femA and femB gene of S.aureus

图2 金黄色葡萄球菌SP－3分离株超抗原毒素基因PCR扩增Fig.2 PCR amplication of sea－see and tst－1genes fromS.aureus SP－3isolate

表2 金黄色葡萄球菌SP－3分离株携带超抗原毒素基因型Table 2 Genotypes of the S.aureus SP－3isolate harboring superantigenic toxins

3 讨论

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要传染性病原菌，常常通过各种传播途径在牛群中传播，引起奶产量下降，影响乳品质。同时也是引起细菌性食物中毒的主要病原菌，且在整个细菌性食物中毒案例中位居前列。金黄色葡萄球菌携带多种肠毒素，随着对其生物学特性和基因水平的探索，发现了许多新型的金黄色葡萄球菌肠毒素，而且肠毒素之间可以水平传播［10］，与金黄色葡萄球菌的致病性有一定的相关性；另外，超抗原肠毒素基因的分布与菌株的来源也存在一定的相关性［11］。因此，金黄色葡萄球菌超抗原肠毒素的检测与分型，为金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的防治和监控金黄色葡萄球菌毒素引起的食物中毒及追溯污染源提供了理论依据。

金黄色葡萄球菌femA或femB基因为其特异性检测靶基因，在金黄色葡萄球菌中高度保守［12］，利用femA或femB基因作为金黄色葡萄球菌阳性对照的PCR方法已有很多报道，本研究建立的PCR方法检测SP－3分离株存在femA和femB基因，证实SP－3分离株为金黄色葡萄球菌。femA和femB基因是MRSA所特有的mecA基因的辅助调控基因，在与mecA基因协同才能表达对甲氧西林的耐药性具有重要的作用。因此，检测femA基因或femB基因可作为金黄色葡萄球菌快速鉴定及耐药性的判断。

同一金黄色葡萄球菌菌株可以检测到多种肠毒素基因型，且并存的频率较高。本研究分离的SP－3株经检测，共检出sea、sec、sed和tst－1 4种超抗原肠毒素基因，这与夏胜超等［13］从隐性乳腺炎乳样中分离的12.3%（7／57）阳性菌株携带毒素情况一致。Larsen H D等［14］报道sec、sed 和tst－1 是奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生的重要毒素，而安福生等［15］报道sea、sec和tst－1是奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生的重要毒素，均少于SP－3分离株携带的毒素种类，表明本地区奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌具有较强的致病性，与奶牛乳腺炎患病率较高相符，金黄色葡萄球菌分离株携带肠毒素基因比例比较高，且含有多种不同类型的肠毒素基因。谢秀兰等［16］报道了宁夏地区奶牛隐性乳腺炎金黄色葡萄球菌分离株肠毒素基因的检出率及种类多于临床型乳腺炎，SEA－SEE均被检出，但未检测TSST－1超抗原毒素。国内外研究报道已经从生牛乳及乳制品金黄色葡萄球菌分离株中检测出 SEA－SEE、SEG－SEI、SElJ、SElQ、SER 及 TSST－1 等 多 种 超 抗 原 毒素［17－19］，涵盖了目前发现的多种金黄色葡萄球菌肠毒素，不同地域的分离菌株携带肠毒素基因型存在一定的差异，为防治金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎带来困难。目前本课题组正加大样本数量，对四平地区及其他地区乳源金黄色葡萄球菌的分离及其肠毒素的检测，为降低奶牛乳腺炎的患病率，确保乳源的安全奠定基础。今后将进一步开展多地区动物及动物性食品金黄色葡萄球菌超抗原毒素基因分型，为深入研究毒素基因的分布与菌株来源的相关性奠定基础，为防控人和动物金黄色葡萄球菌感染提供更可靠的理论依据。

［1］ 郭海勇，郭伟生，崔京春，等.理化因素对葡萄球菌无毒诱变超抗原GST－mTSST－1免疫活性的影响［J］.华南农业大学学报，2011，32（2）：48－51.

［2］ XieY P，He Y P，Gehring A，et al.Genotypes and toxin gene profiles of Staphylococcus aureus clinical isolates from China［J］.PLoS One，2011，6（12）：e28276.

［3］ Argudín M A，Mendoza M C，González－Hevia M A，et al.Genotypes，exotoxin gene content，and antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus strains recovered from foods and food handlers［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78（8）：2930－2935.

［4］ Vasconcelos N G，Pereira V C，Araújo Júnior J P，et al.Mo－lecular detection of enterotoxins E，G，H and I in Staphylococcus aureus and coagulase－negative staphylococci isolated from clinical samples of newborns in Brazil［J］.J Appl Microbiol，2011，111（3）：749－762.

［5］ Yu C C，Wan W L，Chin M F，et al.PCR detection of staphylococcal enterotoxins（SEs）N，O，P，Q，R，U，and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food－poisoning cases in Taiwan［J］.Int J Food Microbiol，2008，121（1）：66－73.

［6］ Ono H K，Omoe K，Imanishi K，et al.Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins，types S and T［J］.Infect Immun，2008，76（11）：4999－5005.

［7］ Cheung G Y C，Otto M.The potential use of toxin antibodies as a strategy for controlling acute Staphylococcus aureus infections［J］.Expert Opin Ther Tar，2012，16（6）：601－612.

［8］ Omoe K，Hu D L，Takahashi Omoe H，et al.Comprehensive analysis of classical and newly described staphylococcal superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus isolates［J］.FEMS Microbiol Lett，2005，246（2）：191－198.

［9］ 崔京春，郭海勇，张 献，等.人体表金黄色葡萄球菌超抗原毒素基因型系统分析［J］.东北农业大学学报，2013，44（8）：81－86.

［10］ Le Maréchal C，Seyffert N，Jardin J，et al.Molecular basis of virulence in Staphylococcus aureus mastitis［J］.PLoS One，2011，6（11）：e27354.

［11］ 史 红，王 娟，郑增忍，等.金黄色葡萄球菌耐药性及肠毒素分型研究［J］.动物医学进展，2012，33（6）：87－90.

［12］ Giannouli S，Labrou M，Kyritsis A，et al.Detection of mutations in the FemXAB protein family in oxacillin－susceptible mecA－positive Staphylococcus aureus clinical isolates［J］.J Antimicrob Chemother，2010 ，65（4）：626－633.

［13］ 夏胜超，吴聪明，王绍琛，等.奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测［J］.中国兽医杂志，2007，43（4）：23－24.

［14］ Larsen H D，Aarestrup F M，Jensen N E.Geographical variation in the presence of genes encoding superantigenic exotoxins and beta－hemolysin among Straphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Europe and USA［J］.Vet Microbiol，2002，85（1）：61－67.

［15］ 安福生，董玉兰，马保臣.奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌超抗原的检测［J］.中国兽医杂志，2008，44（3）：9－11.

［16］ 谢秀兰，刘溪源，王建东，等.乳源金黄色葡萄球菌9种肠毒素基因的检测［J］.动物医学进展，2014，35（7）：25－28.

［17］ 王 娟，黄秀梅，刘书科，等.牛奶中金黄色葡萄球菌的耐药性及其肠毒素分型研究［J］.中国兽医杂志，2013，49（3）：30－32.

［18］ Hummerjohann J，Naskova J，Baumgartner A，et al.Enterotoxin－producing Staphylococcus aureus genotype B as a major contaminant in Swiss raw milk cheese［J］.J Dairy Sci，2014，97（3）：1305－1312.

［19］ Rahimi E.Enterotoxigenicity of Staphylococcus aureus isolated from traditional and commercial dairy products marketed in Iran［J］.Braz J Microbiol，2013，44（2）：393－399.