角蛋白19片段单克隆抗体的制备及鉴定

张慧茹，翟晋豫，刘 珍，王雪琴，孟素香

（1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001；2.河南省生物工程技术研究中心，河南郑州450001）

细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）是一类存在于肺泡、腺泡、子宫内膜等组织单层上皮细胞中的酸性蛋白质，正常状态下为寡聚体，其分子质量为40ku，pI值为5.2，以非可溶的形式存在于细胞骨架中，当细胞发生癌变后，CK19会随着细胞的降解以可溶性片段的形式释放到血液中。1992年，Bodenmuler H［1］利用细胞融合技术，制备出了2株单克隆抗体，即BM19.21和 KS19.1，经免疫学测定，这两种抗体可特异性地与CK19中的某些片段相结合。随后，将这两种抗体结合的抗原片段命名为CYFRA21－1，即目前所指的细胞角蛋白19片段。

国内外大量研究报道指出，CYFRA21－1可作为口腔鳞状细胞癌、宫颈鳞癌、肺癌、胰腺癌等上皮细胞肿瘤性疾病的标志物［2－3］，通过检测 CYFRA21－1在血清中含量的变化，可用于癌症患者上皮细胞癌的生长状况和患者愈后的分析。目前常用德国Roche、法国CIS等国外试剂盒进行检测。与国外产品相比，国内研发的检测试剂盒存在特异性差、灵敏度低等问题。因此，制备高效价特异性CYFRA21－1单克隆抗体，可为诊断检测试剂盒的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

CYFRA21－1抗原为美国Cal Bioreagents公司产品；成年雌性Balb／c小鼠为郑州大学医学院实验动物中心饲养；Quick AntibodyTM免疫佐剂为北京康碧泉生物科技有限公司产品；SP2／0小鼠骨髓瘤细胞由河南工业大学动物生理实验室保存；HAT、PEG4000、RPMI－1640培养基均为 Gibco公司产品；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）为上海尚宝生物科技有限公司产品；HRP－羊抗鼠IgG为Jackson公司产品；重组蛋白A亲和层析柱为上海工硕生物技术有限公司产品；小鼠亚型鉴定试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 抗原免疫 取5只雌性 Balb／c小鼠，按Quick AntibodyTM免疫佐剂使用说明，在每只小鼠大腿肌肉注射抗原与佐剂等体积混合溶液，初次免疫抗原使用量为30μg／只，2周后进行2次免疫，抗原使用量为30μg／只。7d后，采集尾血，以间接ELISA法检测抗体效价。同时给对照小鼠按照相同免疫程序注射等体积PBS（pH7.2）溶液，获得对照血清。融合前5d，尾静脉注射50μg／只的抗原加强免疫。

1.2.2 间接ELISA检测方法的建立 参照河南工业大学动物生理实验室常规ELISA检测体系，采用棋盘法建立间接ELISA检测方法。调整CYFRA21－1抗原浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μg／mL，37℃包被2h，洗涤1遍，每孔加入含10g／L BSA的PBST溶液150μL，37℃封闭2h后，拍干。将1 000倍稀释的抗原免疫小鼠血清作为阳性、注射PBS的小鼠血清作为阴性分别加入，37℃温育30min后，PBST洗涤5遍、拍干，将HRP－羊抗鼠IgG 稀释4 000、5 000、6 000、7 000、8 000倍，按每孔100μL加入，37℃温育30min，PBST洗涤5遍、拍干，加入TMB显色剂，37℃下温育20min，用2mol／L的H2SO4终止反应，测定各孔450nm的吸光值，依据P／N值最大原则确立间接ELISA检测方法的条件。

1.2.3 细胞融合及mAb筛选 挑选CYFRA21－1抗体效价高的小鼠作为融合用鼠进行细胞融合。培养SP2／0骨髓瘤细胞至对数生长期，同时制备免疫小鼠的脾脏细胞悬液，分别计数后，以1∶5～1∶10的比例混合，用50%PEG 4 000进行细胞融合。将融合细胞以2.0×106个／孔铺在含饲养层的96孔板中，加入5μg／mL的HAT筛选培养液培养杂交瘤细胞。在培养第3天半量换液，6d以后全量换液，培养10d后，观察杂交瘤细胞形成的克隆团数目，统计融合率；第11天取含克隆团细胞的培养上清液，采用间接ELISA法检测克隆团上清中的抗体效价。将抗体阳性孔的细胞以有限稀释法进行细胞的单克隆化，统计克隆率及阳性率，细胞单克隆化以所有细胞孔呈现100%阳性率为止。

1.2.4 小鼠腹水mAb的制备及纯化 将筛选得到的单克隆细胞株以106个细胞／只注入小鼠腹腔制备腹水。待小鼠腹水生成至最大量，脱颈处死小鼠，收集腹水，以间接ELISA法检测腹水抗体效价。采用辛酸硫酸铵法、蛋白A柱对腹水中的抗体进行纯化。

1.2.5 mAb的鉴定 以SDS－PAGE、紫外分光光度法检测抗体纯度和浓度；利用鼠抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体进行亚型鉴定；采用阻断ELISA法［2］测定 mAb的敏感性（IC50）。

1.2.6 特异性鉴定 参考孙敏华等［3－4］的研究方法建立双抗体夹心ELISA检测方法，分别检测CK8、CK18、人绒毛促性腺激素（HCG）、人促卵泡素（FSH）是否与CYFRA21－1之间存在交叉反应，检验检测方法的特异性。

2 结果

2.1 间接ELISA检测方法的确立

采用棋盘法筛选，将包被抗原与酶标抗体进行倍比稀释，按照P／N值最高、阳性的吸光度大于阴性对照2倍以上的原则，确定抗原包被浓度为0.4μg／mL、HRP－羊抗鼠IgG抗体稀释6 000倍时为最佳的间接ELISA检测条件。

2.2 小鼠pAb的检测

加强免疫后第7天采集小鼠尾血，采用间接ELISA法检测血清的抗体效价。检测结果如表1所示。以大于阴性OD值（不足0.05按照0.05计算）2.1倍为效价检测最低水平判断，结果表明，2号、3号小鼠血清的抗体效价达到2×105，较其余小鼠高，选择这2只小鼠为脾细胞的来源鼠。

2.3 细胞融合及其克隆化筛选

细胞融合第10天，统计细胞克隆团数目，融合率达到84.17%。融合第11天检测培养液上清，筛选得到4株分泌高效价抗体的阳性杂交瘤细胞株，分别命名2F9、3H5、7C3、6F11。结果如表2所示。

3H5经4次克隆化到达100%克隆率，其余经3次克隆化达到100%的克隆率。

2.4 mAb效价的检测

将4株单克隆细胞株注入小鼠腹腔，7d～14d收集腹水，采用倍比稀释法，用间接ELISA方法检测腹水效价，结果见图1。

结果显示，4株单抗2F9、3H5、7C3、6F11腹水中抗体效价分别为2.56×105、5.12×105、5.12×105、2.56×105。

表2 杂交瘤细胞株的克隆Table 2 Coloning of hybridoma cells

图1 mAb腹水效价（1 000×）Fig.1 The titration of monocolonial antibody in ascites（1 000×）

2.5 mAb的纯化及浓度测定

利用辛酸硫酸铵法、蛋白A层析柱纯化腹水抗体。经SDS－PAGE证实，4株单克隆抗体电泳均形成2条大小分别约为55ku和25ku的条带，符合鼠源抗体特点（图2）。将纯化后的抗体蛋白稀释100倍后，经紫外分光光度测定吸光度值，依据蛋白浓度与吸光度值的关系计算抗体蛋白浓度（表3）。

图2 纯化后抗体SDS－PAGE检测Fig.2 Detection of purified antibodies by SDS－PAGE

2.6 mAb的亚型鉴定

用抗体亚型检测试剂盒对4株mAb的抗体亚型进行鉴定，4株mAb的亚型均为IgG1类。

2.7 mAb的敏感性测定

采用阻断ELISA方法，测定4株mAb的IC50结果见表4。绘制各株mAb抗体的抑制曲线。

表3 紫外分光光度测定纯化的抗体蛋白浓度Table 3 Detection of purified antibody concentration by ultraviolet spectrometry mg／mL

表4 mAb的敏感性测定Table 4 Sensitivity detection of mAb

由图3计算，2F9的回归方程为y＝－0.353 4x＋0.507 9，R2＝0.989 7，2F9 的 IC50为1.03ng／mL；3H5的回归方程为y＝－0.419 8x＋0.581 8，R2＝0.980 5，3H5的IC50为1.53ng／mL；7C3的回归方程为y＝－0.381 1x＋0.559 6，7C3的IC50为1.40ng／mL；6F11 的 回 归 方 程 为 y＝－0.412 5x＋0.535 5，6F11的IC50为1.21ng／mL，说明4株单克隆抗体的敏感性均较好，满足试剂盒单克隆抗体要求。

2.8 单克隆抗体特异性鉴定

为验证获得的4株单抗特异性，与角蛋白家族CK8、CK18及人血清中存在的CYFRA21－1类似物人绒毛促性腺激素（HCG）、人促卵泡素（FSH）进行间接ELISA法检测后对比显示，筛选获得的4株单克隆抗体与其他各类物质间的交叉反应率均小于0.1%，说明其特异性较好（表5）。

图3 4株mAb的抑制曲线Fig.3 Inhibition curves of 4mAb strains

表5 CYFRA21－1与类似物的交叉反应性Table 5 The cross－reactivity of CYFRA21－1with its analogs

3 讨论

众多研究表明，细胞角蛋白19（CK19）可作为检测上皮性实体癌血源性微转移的靶基因，血清中CYFRA21－1的含量可作为肺癌、食管癌等相关上皮细胞癌变的诊断参考指标之一［5－6］。但国内针对检测 CYFRA21－1的试剂盒报道并不多见［7］。王彪等［8］采用时间分辨荧光免疫法制备CYFRA21－1试剂盒，通过分析比较1 057例血清CYFRA21－1浓度发现，正常人血清中CYFRA21－1的浓度在0ng／mL～4.0ng／mL；张忠英等［9］随机调查70名正常人血清中 CYFRA21－1的浓度，确定其参考值为1.84ng／mL±0.65ng／mL，因此设定正常人血清CYFRA21－1的均值为3.36ng／mL，与Roch公司提供的参考值≤3.3ng／mL接近；闵钟云等［10］在研究喉癌病例时发现，对照组血清CYFRA21－1浓度为2.43ng／mL±1.09ng／mL，而喉癌组CYFRA21－1的浓度为5.16ng／mL±3.64ng／mL。从上述研究中可以看出，人血清中CYFRA21－1的含量较低，且随着疾病的发生出现微量的变化，因此，需要制备灵敏性较高的单克隆抗体才能适用于血清CYFRA21－1的检测。

小细胞肺癌主要表达CK18，有时可有CK8和CK19表达，而肺腺癌发病过程中有CK7、CK8、CK18和CK19的同时表达，鳞癌时也有大量角蛋白因子表达［11］，为此检测 CYFRA21－1与代表性角蛋白因子CK8、CK18的交叉反应；人绒毛促性腺激素（HCG）、人促卵泡素（FSH）是血清中 CYFRA21－1的主要类似物［7］。因此，测定其与 CK8、CK18、HCG、FSH的交叉反应，以确定4株单抗的反应特异性。

本研究采用Quick AntibodyTM免疫佐剂，比常规免疫3次～4次减少了一半，不仅节省抗原、减少免疫乳化的操作，且多克隆抗体产生快、效价高，该佐剂的使用为细胞融合提供了优质的候选小鼠。在高融合率的保证下，通过单克隆化筛选获得4株分泌高效价单克隆抗体的细胞株，将细胞株注入腹腔制备腹水，常规方法纯化抗体后，获得的4株单克隆抗体IC50在1.0ng／mL～1.5ng／mL之间，能够满足正常人血清中低水平CYFRA21－1含量检测的需要。

本试验采用Quick AntibodyTM免疫佐剂与CYFRA21－1抗原混合的方式免疫小鼠，采取产生高效价多克隆抗体的小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选获得4株高效价、敏感性强的IgG1型CYFRA21－1单克隆抗体，为后期制备CYFRA21－1检测试剂盒奠定了基础。

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