内质网应激反应蛋白在氧化应激诱导人宫颈癌Hela细胞自噬中的作用

于春艳，刘 希，于春荣，张 钰，苏 静，刘玉和，康劲松

（1.北华大学基础医学院病理学教研室，吉林 吉林 132013；2.北华大学化学与生物学院，吉林 吉林 132013；3.北京昭衍新药研究中心有限公司毒理部，北京100176；4.吉林大学基础医学院病理生理学教研室，吉林 长春 130021）

氧化应激可能通过引起蛋白氧化及积聚诱导内质网应激[1－2]。当错误折叠蛋白积聚在内质网腔内，内质网未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）被激活。内质网通过增强蛋白折叠能力或促使错误折叠蛋白至细胞浆而被蛋白酶体降解，发挥促细胞生存作用。为了清除内质网内不能被蛋白酶体降解的错误折叠蛋白，UPR可能上调细胞自噬而发挥作用[3－4]。本文作者前期研究[5]发现：氧化应激诱导剂维生素K3（VK3）能诱导Hela细胞发生自噬。然而，VK3是否能激活内质网UPR，以及UPR在氧化应激诱导自噬中的作用尚不清楚。因此，本实验以Hela细胞为研究对象，利用VK3复制氧化应激模型，应用内质网应激抑制剂牛磺熊去氧酸钠（tauroursodeoxycholic acid sodium，TUDC）观察VK3是否激活内质网应激反应蛋白，及被激活的内质网应激反应蛋白在VK3诱导Hela细胞自噬中的作用，初步探索内质网应激－自噬途径在调控肿瘤细胞生存过程中的作用，为肿瘤的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1

.1 材 料 人Hela细胞购自中国科学院和北京协和医院；新生小牛血清（Gibco公司，美国），IMDM培养基（Hyclone公司，美国），MTT粉末（Sigma公司，美国），细胞裂解液RIPA（碧云天生物技术有限公司）；TUDC、内质网应激特征性分子葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、自噬微管相关蛋白1轻链3抗 体（microtubule-associated protein 1light chain 3，LC3）及β-actin抗体（Santa Cruz公司，美国）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养 Hela细胞置于完全培养基（10% 新生牛血清，IMDM 培养液，pH7.4）中，37℃、5%CO2培养箱培养。实验分为对照组（细胞用 IMDM 培 养）、VK3（30μmol·L－1）组、TUDC （500μmol·L－1） 组 和 VK3（30μmol·L－1）与TUDC（500μmol·L－1）联合作用组。

1.3 透射电镜观察内质网形态学变化 各组细胞1 000r·min－1离心10min，取沉淀细胞团，经2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB2Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片，醋酸双铀及柠檬酸铅双重染色，JEM21200EX型透射电镜观察、对比观察其超微结构的变化，并摄片。

1.4 MTT法检测细胞生存率 各组细胞浓度为1×104/孔，以每孔100μL接种于96孔培养板，每组细胞5复孔。于培养结束前4h，加入5g·L－1MTT 20μL。培养结束后，倾去培养基，每孔加入DMSO 150μL，微量振荡器混匀，使结晶完全溶解，用酶标仪于570nm波长处测定其吸光度（A）值，间接反映活细胞数量，用以计算细胞生存率。对照组细胞生存率为100%，其余各组细胞生存率＝（各细胞组A值/对照组A值）×100%。

1.5 Western blotting法检测GRP78和膜型LC（LC3-Ⅱ）蛋白表达 用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，以β-actin的水平作为等量蛋白质上样对照，取50μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维素膜上；5%奶粉室温封闭2h后，用含0.01%Tween20的TBS缓冲液（TBST）漂洗3次，每次10min；加入相应的抗体（Santa公司）（1∶200），4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000），37℃摇床温育2h；TBST漂洗3次，每次10min；DAB显色，凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司GIS凝胶成像系统）拍照，同时以β-actin为内参照进行蛋白表达分析，蛋白表达水平以A值比值表示。

2 结 果

2.1 透射电镜观察对照组和VK3组Hela细胞超微结构 透射电镜观察，对照组Hela细胞表现为正常细胞形态，微绒毛多，细胞核圆形。VK3组Hela细胞体积变大，微绒毛减少，核内染色质凝聚，细胞浆内有圆形的空泡生成，空泡内可见内容物，提示细胞内形成了自噬泡；细胞浆内还可见扩张的内质网。见图1。行统计学处理，细胞生存率及GRP78和LC3－Ⅱ蛋白表达水平以

图1 透射电镜观察各组Hela细胞内质网超微结构Fig.1 Ultrastructure of endoplasmic reticulum of Hela cells in various groups observed by transmission electron microscope

2.2 MTT法检测各组Hela细胞生存率 对照组细胞生存率为100%，TUDC组细胞生存率为98.9%±1.23%。与 VK3组（68.1% ±1.53%）比较，VK3与TUDC联合作用组细胞存活率（30.8%±3.37%）明显降低（P＜0.05）。

2.3 Western blotting法检测Hela细胞GRP78和LC3-Ⅱ蛋白表达水平 与对照组（0.68±0.03）比较，VK3组GRP78的表达水平（0.79±0.05）增加（P＜0.05）；与 VK3 组比较，VK3 与TUDC联合作用组GRP78的表达水平（0.59±0.03）降低（P＜0.05）；与对照组比较，TUDC组GRP78的表达水平（0.67±0.02）无明显变化（P＞0.05），表明 TUDC减弱了 VK3诱导的UPR。见图2。

与对照组（0.56±0.02）比较，VK3 组LC3-Ⅱ表达水平（0.72±0.04）增加（P＜0.05），TUDC组LC3－Ⅱ表达水平（0.55±0.01）无明显变化（P＞0.05）；与 VK3 组比较，VK3 与TUDC联合作用组LC3-Ⅱ蛋白表达水平（0.55±0.02）降低（P＜0.05）。见图3。

图2 Western blotting法检测各组Hele细胞GRP78表达Fig.2 Expressions of GRP78in Hela cells in various groups detected by Western blotting method

图3 Western blotting法检测各组Hela细胞LC3-Ⅱ蛋白表达Fig.3 Expressions of LC3-Ⅱ protein in Hela cells in various groups detected by Western blotting method

3 讨 论

在真核细胞中，内质网参与细胞蛋白质合成、修饰及运输过程。抗肿瘤药物、氧化应激能导致内质网平衡的紊乱，发生内质网应激[6]。内质网上待折叠修饰蛋白过载，造成未折叠蛋白在内质网中累积被称为UPR，包括内质网分子伴侣GRP78/BIP（glucose-regulated protein 78 / binding immunoglobulin protein）等及其下游的信号传导通路相关蛋白[7]。内质网应激会引起从内质网到细胞质和细胞核的信号传导，通过暂时抑制蛋白质翻译、增加内质网内具有折叠能力的基因转录而减少内质网内的蛋白负担，最终帮助细胞恢复稳态并得以存活。如果这个转录程序不能重新恢复适当的内质网稳态，那么持续的内质网应激将诱导细胞死亡[8]。有研究[9]发现：RNA 干扰 GRP78蛋白表达，使顺铂和阿霉素诱导黑色素瘤细胞的凋亡增多。本研究电镜结果显示：VK3组细胞可见内质网扩张，GRP78表达增加；与VK3组比较，VK3与TUDC联合应用组Hela细胞生存率降低。本研究结果提示：在VK3诱导氧化应激时内质网应激反应增强，被激活的内质网应激反应蛋白可能减轻氧化应激导致的损伤。

细胞自噬是指细胞内内容物被双层膜形成的自噬泡包裹，并运送到溶酶体形成自噬溶酶体并降解其内容物的过程[10]。LC3蛋白具有2种细胞形式，即LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ。LC3-Ⅰ在自噬体形成过程中通过接合PE转变成LC3－Ⅱ，因此LC3－Ⅱ的数量是自噬体形成的早期标志物。有研究[11]发现：顺铂作用Hela细胞激活的内质网应激反应，介导了细胞自噬的发生。自噬可清除受损或多余的蛋白质及细胞器，对于细胞保持稳态具有重要意义，尤其在细胞发生应激时的生存机制中起决定性作用[12－13]。本研究结果显示：TUDC 联合 VK3作用，降低了VK3诱导的自噬相关蛋白LC3－Ⅱ的表达和内质网应激反应蛋白GRP78的表达，表明VK3诱导的氧化应激通过激活内质网应激反应蛋白，介导了细胞自噬的发生，内质网应激和自噬在功能上有联系。本课题组的前期研究[14]结果显示：VK3激活的自噬能清除泛素化蛋白，减少线粒体途径细胞凋亡。结合以上结果，本文作者认为：VK3诱导的内质网应激反应蛋白介导发生的细胞自噬，可能通过清除细胞内被氧化应激损伤的蛋白及细胞器，具有减轻氧化应激损伤作用。

有研究[13，15－16]发现：自噬体的膜可以从内质网膜衍生出来。在清除错误折叠蛋白方面，内质网膜和自噬体膜之间似乎存在着直接动态的相互作用。目前，内质网应激诱导自噬发生的信号途径还有待于进一步研究。

[1]van der Vlies D，Makkinje M，Jansens A，et al.Oxidation of ER resident proteins upon oxidative stress：effects of altering cellular redox/antioxidant status and implications for protein maturation [J].Antioxid Redox Signal，2003，5（4）：381-387.

[2]Malhotra JD，Kaufman RJ.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress：a vicious cycle or a double-edged sword？[J].Antioxid Redox Signal，2007，9（12）：2277-2293.

[3]Ding WX，Ni HM，Gao W，et al.Differential effects of endoplasmic reticulum stress-induced autophagy on cell survival[J].J Biol Chem，2007，282（7）：4702-4710.

[4]徐 冶，钟加滕，李晓宁，等.缺糖缺氧对经内质网应激途径诱导Hela细胞凋亡的影响 [J].吉林大学学报：医学版，2011，37（5）：821-824.

[5]于春艳，李洪岩，钟加滕，等.维生素K3通过下调mTOR信号途径而诱导 HeLa细胞自噬 [J].中国药理学通报，2009，25（9）：1173-1176.

[6]Ding WX，Yin XM.Sorting，recognition and activation of the misfolded protein degradation pathways through macroautophagy and the proteasome[J].Autophagy，2008，4（2）：141-150.

[7]Xu C，Bailly-Maitre B，Reed JC.Endoplasmic reticulum stress：cell life and death decisions[J].J Clin Invest，2005，115（10）：2656-2664.

[8]Verfaillie T，Salazar M，Velasco G，et al.Linking ER stress to autophagy：Potential implications for cancer therapy[J].Int J Cell Biol，2010，Jan 17.dio：10.1155/2010/930509.

[9]Jiang CC， Mao ZG， Avery-Kiejda KA，et al.Glucoseregulated protein 78antagonizes cisplatin and adriamycin in human melanoma cells[J].Carcinogenesis，2009，30（2）：197-204.

[10]Mizushima N， Yoshimori T， Levine B. Methods in mammalian autophagy research [J].Cell，2010，140（3）：313-326.

[11]徐 冶，李晓宁，钟加滕，等.缺糖缺氧经内质网应激途径诱导宫颈癌 Hela细胞自噬 [J].中国妇幼保健，2011，26（26）：4089-4091.

[12]Yu H，Su J，Xu Y，et al.p62/SQSTM1involved in cisplatin resistance in human ovarian cancer cells by clearing ubiquitinated proteins [J].Eur J Cancer，2011，47（10）：1585-1594.

[13]Zhong JT，Xu Y，Yi HW，et al.The BH3mimetic S1 induces autophagy through ER stress and disruption of Bcl-2/Beclin 1interaction in human glioma U251cells [J].Cancer Lett，2012，323（2）：180-187.

[14]Yu C，Huang X，Xu Y，et al.Lysosome dysfunction enhances oxidative stress-induced through ubiquitinated protein accumulation in Hela Cells [J]. Anat Rec（Hoboken），2013，296（1）：31-39.

[15]王 冲，余 建，黄 河.PIK1磷酸化修饰Pin X1对宫颈癌Hela细胞有丝分裂及凋亡的影响 [J].郑州大学学报：医学版，2013，48（3）：323-327.

[16]林爱琴，朱晓菡，吕新全，等.宫颈鳞状细胞癌组织中Bmi-1表达 [J].郑州大学学报：医学版，2013，48（1）：81-83.