新疆哈萨克族人弗林蛋白Furin基因变异与高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症的相关性

王红梅，李南方，洪 静，罗文利，严治涛，王新玲，朱 沂，沈 岩

1中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院博士后流动站，北京 100005 新疆维吾尔自治区人民医院 2博士后工作站 3高血压科，乌鲁木齐 830001

4中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

新疆哈萨克族人弗林蛋白Furin基因变异与高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症的相关性

王红梅1，2，李南方3，洪 静3，罗文利3，严治涛3，王新玲3，朱 沂3，沈 岩4

1中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院博士后流动站，北京 100005 新疆维吾尔自治区人民医院2博士后工作站3高血压科，乌鲁木齐 830001

4中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005

目的研究新疆哈萨克族人高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症与弗林蛋白 (Furin)基因变异的相关性。方法本研究是以横断面流行病学调查为基础的病例-对照研究，878例研究对象均来自新疆哈萨克族自然人群。测定48例随机选择的哈萨克族高胆固醇血症患者 (女性24例、男性24例)弗林蛋白基因启动子、外显子区序列，筛查代表性变异。采用TaqMan PCR分析弗林蛋白基因变异在878例哈萨克族自然人群 (男性370例、女性508例)中的分型，分析其与哈萨克族人血总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平的相关性。结果在48例高胆固醇血症患者中，共筛查出弗林蛋白基因的12个变异，包括4个代表性变异 (rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178)。4个代表性变异均在大样本哈萨克族人中基因型分型成功 (成功率≥99%)。在哈萨克族自然人群中，rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178多态性的基因型、等位基因、单体型频率分别在高胆固醇血症组、对照组间及高低密度脂蛋白胆固醇血症组、对照组间的分布差异均无统计学意义 (P均＞0．05);每个多态性的不同基因型携带者之间的血总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇平均水平差异无统计学意义 (P均＞0．05)。结论新疆哈萨克族人高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症与弗林蛋白基因变异不相关，该变异可能不是哈萨克族人高胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症的易感因素。

弗林蛋白基因;高胆固醇血症;高低密度脂蛋白胆固醇血症;哈萨克族;基因变异

Acta Acad Med Sin，2014，36(2)：168-175

自1990年起，心血管疾病就持续居于我国居民死亡原因的首位，是重要的公共卫生问题。1998年WHO全球健康报告显示：如果不加以控制，到2030年我国冠心病患病率将比2000年增加3．7倍。而控制心血管疾病的危险因素是预防心血管疾病的主要措施。血脂异常是心血管病主要的、可控制的危险因素之一。研究表明血脂异常 ［总胆固醇 (total cholesterol，TC)及低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoprotein cholesterol，LDL-c)增加，高密度脂蛋白胆固醇下降］可显著增加冠心病发病危险［1-3］。虽然饮食摄入脂肪增多、代谢异常等因素是血脂异常的主要发病原因;但研究表明遗传因素在血脂异常的发病过程中发挥重要作用［4-5］。

弗林蛋白 (Furin)是真核生物中广泛存在一种内切蛋白酶，能将许多重要的多肽和蛋白前体剪切加工成具有生物活性的形式［6］。肝脏中高表达的前蛋白转化酶PCSK9通过与LDL受体结合，介导LDL靶向降解，是保持内环境中TC稳态的关键机制;弗林蛋白是影响肝脏调节PCSK9活性和表达的重要因子［7］。因此，推测弗林蛋白可能参与了高TC血症、高LDL-c血症的发生、发展过程。

新疆哈萨克族高发血脂异常［8-10］。由于受文化、信仰、风俗、饮食多种因素影响，该民族极少与异族通婚，遗传背景高度同源;同时该民族至今仍保留有相对完整的隔离人类遗传体系，是研究多基因复杂疾病的理想人群。前期研究表明：该民族人群高LDL-c血症与β2-肾上腺素能受体基因变异相关，但是血管紧张素Ⅱ-1型受体基因的单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNPs)与该人群血脂紊乱不相关［11-13］。本研究通过测定弗林蛋白外显子区、启动子区及其周围序列，筛查新疆哈萨克族人群特异性的弗林蛋白代表性SNPs，并在哈萨克族自然人群中进行分型，分析其与哈萨克族高TC血症、高LDL-c血症表型的关系，从遗传学角度探讨血脂异常的易感机制，以期为血脂异常的防治提供参考依据。

对象和方法

对象采用多级随机抽样的方法，对阜康地区有本地正式户口、30～60岁、3代内无异族通婚史的长住哈萨克族居民进行流行病学现况调查。调查前事先登记人口，保证应答率，保证入选个体均为无关个体。在剔除了近1个月服用调脂药物或可能影响血脂的其他药物者后，最终有878例 (男性370例、女性508例)入选。研究对象知情同意并签署知情同意书。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理委员会审查并同意实施。

方法本研究为以自然人群横断面流行病学调查为基础的病例-对照研究。采用问卷调查方法，由经过统一培训的、精通哈萨克萨克语的专职人员填写表格、询问病史、体格检查。所有研究对象均由培训合格的专业人员按照标准方法收集一般资料，包括性别、年龄、身高、体重、收缩压、舒张压等。

血TC和LDL-c测定抽取每位受试者空腹静脉血5 ml，离心，分离血清和血细胞。在采血后1个月内血清用于血脂检测，血细胞-80℃保存备用。血脂测定由新疆维吾尔自治区人民医院检验科派专人完成。依据《中国成人血脂异常防治指南》［14］的推荐标准诊断高TC血症和高LDL-c血症，即TC≥6．22 mmol/L为高TC血症，LDL-c≥4．14 mmol/L为高LDL-c血症。878例研究对象中高TC血症190例 (对照组688例)，高LDL-c血症249例 (对照组629例)。

弗林蛋白基因测序、变异位点筛查和SNPs分析采用PAXgene Blood DNA试剂盒 (QIAGEN，Hilden，德国)，按照试剂盒提供的操作步骤提取研究对象血细胞的基因组DNA。在总体样本中随机选择48例30～60岁高TC血症患者，采用3100XL基因分析仪 (Applied Biosystems，加利福尼亚，美国)对弗林蛋白编码区和启动子区测序。采用Sequencher 4．7基因序列分析软件 (Gene Codes公司，密歇根州，美国)将测定序列与弗林蛋白基因标准序列比对，确定变异位点及变异性质。采用专业遗传学分析软件SNPAlyze Ver．7．0．1 pro(Dynacom，千叶，日本)分析该人群特异性的SNPs位点及变异位点间的连锁不平衡 (linkage disequilibrium，LD)关系。

Taqman PCR选择代表SNPs位点进行基因分型。基因型鉴定采用ABI 7900HT PCR仪 (Applied Biosystems)。PCR的反应体系：总体积25 μl，包括人TaqMan基因多态性分型预混液 (Applied Biosystems)12．5 μl、单核苷酸多态性分型探针/引物预混液(Applied Biosystems)1．25 μl、DNA 模板 (20 ng/μl)2 μl、去离子水 9．25 μl。反应条件：预变性 (95 ℃、10 min、1个循环)，变性 (92℃、15 s) +退火 (60℃、1 min)+延伸(72℃、1 min)43个循环，总延伸 (72℃、7 min、1个循环)。

统计学处理采用 SPSS 16．0(SPSS Inc．，伊利诺斯州，美国)统计软件包进行数据处理。计量资料用均数±标准差表示，计数资料用百分数表示。组间临床表型计量资料比较采用t检验 (两组间)或单因素方差分析 (3组间)或者协方差分析 (校正影响因素)，分类资料采用卡方检验。由基因型频率计算等位基因频率，Hardy-Weinberg平衡检验、两组间等位基因频率和基因型频率比较、单体型分析采用专业的遗传学分析软件 SNPAlyze Ver．7．0．1 pro。P ＜0．05 为差异具有统计学意义。

结 果

临床资料与对照组比较，高TC组的平均年龄、收缩压、舒张压、TC、LDL-c增高，差异具有统计学意义 (P均＜0．05)，两组间吸烟者、性别比例的差异具有统计学意义 (P均＜0．05)。高LDL-c组的平均年龄、体重指数、收缩压、舒张压、TC、LDL-c均高于对照组，差异具有统计学意义 (P均＜0．05)，两组间性别及吸烟、饮酒者比例的差异具有统计学意义(P 均 ＜0．05)(表1)。

弗林蛋白基因测序结果在48例高TC血症患者的弗林蛋白基因外显子及其周围部分内含子、转录起始点上游1 000 bp测序范围内共检出12个变异位点，其中7个变异 ［-7315C＞A(rs4932178)、1970C＞G(rs2071410)、2003T＞C(rs1573643)、4369G＞T(rs6225)、4573G ＞T(rs6224)、5604G ＞C(rs6226)、6262C＞T(rs6227)］与NCBI公共数据库报道的变异一致;其余5个为新发现的变异位点 (表2)。在筛查出的12个变异位点中，-7315C＞A(rs4932178)、1970C＞G(rs2071410)、2003T＞C(rs1573643)、4573G＞T(rs6224)、5604G＞C(rs6226)、6262C＞T(rs6227)为高频率SNPs，其余为低频率SNPs或稀有突变，未筛查出错义突变。

在12个SNPs位点间，-7315C＞A(rs4932178)与4573G＞T(rs6224)存在LD;1970C＞G(rs2071410)与2003T＞C(rs1573643)存在LD，其余变异位点间无LD关系。因为低频率SNPs均在非编码区，而另外3个稀有突变虽然在外显子区，但是为同义突变，结合LD分析结果，最终选择rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178等4个代表性SNPs在大样本新疆阜康牧区哈萨克族人群中进一步研究。

4个代表性SNPs位点的基因分型在878例哈萨克族自然人群中，对弗林蛋白基因rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178多态性成功进行了基因分型，基因分型的读取率均≥99%，重复检测一致率为100%。病例组、对照组的基因型、等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

表1 病例组及对照组临床资料比较Table 1 Comparisons of clinical data of subjects in case and control groups

表2 48例哈萨克族高胆固醇血症者弗林蛋白基因启动子、外显子序列的变异Table 2 Sequence variations in the promoter region and exons in Furin gene identified in 48 Kazakh individuals with hypercholesterolemia

弗林蛋白基因4个代表性SNPs位点与哈萨克族人高TC、高LDL-c的关系在878例哈萨克族自然人群中，rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178多态性的基因型 (包括累加模型、显性模型和隐性模型)、等位基因在高TC组及对照组、高LDL-c组及对照组间的分布差异均无统计学意义 (P均＞0．05)(表3)。4个代表性SNPs位点中的每个多态性位点的不同基因型携带者之间的TC水平差异均无统计学意义 (P均＞0．05);rs6227、rs2071410、rs4932178 中的每个多态性位点的不同基因型携带者之间的LDL-c水平差异均无统计学意义 (P均＞0．05)，虽然rs6226多态性的不同基因型携带者之间的LDL-c水平差异有统计学意义 (P=0．012)，但是采用协方差分析方法校正年龄、体重指数、血压、性别、饮酒等影响因素后，差异无统计学意义 (P ＞0．05)(表 4)。由 rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178组成的常见单体型 (H1～H5)频率在高TC组及对照组、高LDL-c组及对照组间的分布差异均无统计学意义 (P均＞0．05)(表5)。

表3 基因型、等位基因在病例组及对照组间分布频率比较［n(%)］Table 3 Comparison of the genotype and allele distributions in the case and control groups［n(%)］

表4 不同基因型哈萨克族人群血清总胆固醇、低密度脂蛋白水平比较 (±s，mmol/L)Table 4 Comparisons of total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterin levels between Kazakh general population with different genotypes(x－±s，mmol/L)

表4 不同基因型哈萨克族人群血清总胆固醇、低密度脂蛋白水平比较 (±s，mmol/L)Table 4 Comparisons of total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterin levels between Kazakh general population with different genotypes(x－±s，mmol/L)

基因型Genotype 总胆固醇Total cholesterol P 低密度脂蛋白胆固醇Low-density lipoprotein cholesterin P rs6226 C/C(n=295) 4．92 ±1．041 0．140 2．93 ±0．790 0．012 C/G(n=435) 5．06 ±1．045 3．10 ±0．852 G/G(n=136) 4．93 ±0．956 2．95 ±0．956 rs6227 C/C(n=643) 4．99 ±1．017 0．790 3．01 ±1．017 0．840 C/T(n=212) 4．98 ±1．066 3．04 ±0．831 T/T(n=19) 5．13 ±1．149 2．95 ±0．901 rs2071410 C/C(n=637) 4．98 ±1．007 0．602 3．01 ±0．819 0．930 C/G(n=214) 5．01 ±1．088 3．03 ±0．822 G/G(n=18) 5．22 ±1．142 2．99 ±0．913 rs4932178 C/C(n=570) 4．98 ±1．000 0．638 3．01 ±0．814 0．702 C/T(n=260) 5．04 ±1．083 3．04 ±0．836 T/T(n=38)4．93 ±1．0852．92 ±0．842

表5 病例组与对照组弗林蛋白基因单体型频率比较 (%)Table 5 Comparison of hyplotype frequencies of Furin polymorphisms between the case and control groups(%)

讨 论

本研究是新疆哈萨克族人肥胖、高血压等相关代谢性疾病遗传机制系列研究之一。由于NCBI和Hap-Map数据库中未提供新疆哈萨克族人的基因组变异信息，加之基因变异因种族、地域等的不同可表现为不同形式，所以本研究采取直接测序法寻找哈萨克族人弗林蛋白基因的常见SNPs、稀有突变及低频率SNPs，然后根据连锁不平衡关系选取该民族特异性的代表性SNPs，并进一步经流行病学调查和基因分析获得新疆哈萨克族人群弗林蛋白基因分型及与高血脂的关系。

弗林蛋白是真核生物细胞中一种重要的内切蛋白酶，可以识别剪切多种蛋白质，如生长因子、血清蛋白、基质金属蛋白酶、受体、病毒囊膜蛋白和细菌外毒素等［15-16］。在肝脏中高度表达的前蛋白转化酶PCSK9是一种与弗林蛋白高度同源的蛋白酶，PCSK9通过与LDL受体结合，靶向介导LDL受体降解，进而保持TC在内环境中稳态。动物实验证实，当小鼠表达弗林蛋白降低时，其肝脏内的PCSK9活性显著增加，PCSK9的mRNA水平增加35%，LDL受体减少了26%，因此弗林蛋白是影响肝脏调节PCSK9活性和表达的重要因子［7］。故笔者推测弗林蛋白可能参与了高TC血症、高LDL-c血症的发生、发展过程，弗林蛋白的编码基因是高TC血症、高LDL-c血症的候选基因，因此有必要进一步研究该基因变异与哈萨克族人群高TC血症、高LDL-c血症的相关性。

本研究在48例哈萨克族高TC血症患者弗林蛋白基因外显子及其周围部分内含子、转录起始点上游1 000 bp范围内共检出12个变异位点，其中NCBI和HapMap数据库未报道的变异位点5个，未筛查出错义突变，弗林蛋白基因的高度保守性说明弗林蛋白在维持机体正常功能方面具有重要作用。

本研究显示弗林蛋白基因的4个代表性变异位点(rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178) 的基因型、等位基因在高TC血症组与对照组间、高LDL-c血症组与对照组间的分布差异无统计学意义，证实弗林蛋白基因变异可能与新疆哈萨克族人高TC血症、高LDL-c血症不相关。其可能原因有：(1)血脂紊乱是由遗传因素、易感因素与环境因素相互作用的结果，因此有必要进一步联合研究遗传、环境因素及其交互作用在其发病中的作用;此外，作为一种多基因疾病，某一单个基因的变异可能在其发病中的作用甚微，故尚需要进行多基因及基因-基因交互作用研究。(2)关联研究常受到假阴性、假阳性的影响。关联研究出现假阴性结果的主要原因是混杂因素干扰。在诸多混杂因素中，一个极其重要但又常被忽视的因素即是群体的遗传分层现象，这常由遗传背景不一致的亚人群混合所致。群体分层对遗传关联分析的直接影响可能导致结果偏倚，产生假阴性结果。因此，在进行病例对照的关联研究时，应尽可能排除群体分层干扰，如加大样本量、尽可能的选择一个遗传上相对均质的群体等。本研究病例、对照组样本均来自同一地区、同一时间、同一个遗传上相对均质的相对隔离群体，而且该人群 rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178的基因型、等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡，因此本研究的结论是相对可信的。但本研究样本量相对较小，尚需要进一步扩大样本量及在其他民族人群中验证研究结论。

综上，该弗林蛋白基因变异可能与哈萨克族人群高TC血症、高LDL-c血症不相关。

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Relationship between Genetic Variation of Furin Gene and Hypercholesterolemia and Hyper-low-density Lipoprotein Cholesterolemia in Kazakh General Population

WANG Hong-mei1，2，LI Nan-fang3，HONG Jing3，LUO Wen-li3，YAN Zhi-tao3，WANG Xin-ling3，ZHU Yi3，SHEN Yan4

1Postdoctoral Research Station，Institute of Basic Medicine Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China
2Postdoctoral Research Station，3Hypertension Center，the People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China
4State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China

Li Nan-fang Tel：0991-8564818，E-mail：lnanfang@yahoo．com．cn

ObjectiveTo investigate the relationship between the genetic variation of Furin gene and the hypercholesterolemia and hyper-low-density lipoprotein cholesterolemia in Kazakh general population．MethodsBased on a cross-sectional epidemiological study in a Kazakh general population，a case-control study including 878 subjects was conducted．All the sequence variant-located promoters and exon regions of Furin gene were identified by the direct sequencing of PCR products in 48 randomly selected hypercholesterolemic individuals(24 males and 24 females)．After having genotyped the representative polymorphisms in 878 subjects by TaqMan PCR，we investigated the relationship between genetic variation of Furin and hypercholesterolemia/hyper-lowdensity lipoprotein cholesterolemia in these subjects．ResultsTwelve genetic variations in Furin gene were identified by sequencing 48 hypercholesterolemic individuals and 4 common single nucleotide polymorphisms(rs6226，rs6227，rs2071410，and rs4932178)were selected as the representatives for genotyping in these subjects．The rs6226，rs6227，rs2071410，and rs4932178 polymorphisms were successfully genotyped．The distribution of the genotypes，alleles，and haplotypes of rs6226，rs6227，rs2071410，and rs4932178 polymorphisms did not differ significantly between the hypercholesterolemia group and the control groups or between the hyper-low-density lipoprotein cholesterolemia group and the control groups(all P＞0．05) ．The cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol levels did not differ significantly among individuals with different genotypes(all P ＞0．05) ．Conclusion The genetic variation of Furin may not be associated with hypercholesterolemia or hyper-low-density lipoprotein cholesterolemia in Kazakh general population．

Furin;hypercholesterolemia;hyper-low-density lipoprotein cholesterolemia;Kazakh;genetic variation

李南方 电话：0991-8564818，电子邮件：lnanfang@yahoo．com．cn

R544．1;R394．5

A

1000-503X(2014)02-0168-08

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．02．010

国家自然科学基金 (81060030)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81060030)

2013-09-10)

·论 著·