整合素受体介导共载紫杉醇和姜黄素脂质体的构建及其抗肿瘤研究

张小文,吴静,2

(1.焦作市妇幼保健院药剂科, 河南 焦作454000；2.吉林大学第三临床医学院 药学系，吉林 长春 130000）

整合素受体介导共载紫杉醇和姜黄素脂质体的构建及其抗肿瘤研究

张小文1,吴静1,2

(1.焦作市妇幼保健院药剂科, 河南 焦作454000；2.吉林大学第三临床医学院 药学系，吉林 长春 130000）

目的制备整合素受体精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）修饰共载紫杉醇和姜黄素脂质体（RGDLP-PTX/Cu），研究其卵巢癌细胞靶向性以及对卵巢癌的治疗效果。方法采用薄膜分散法制备RGD修饰共载紫杉醇和姜黄素脂质体（RGDLP-PTX/Cu）。观察脂质体的粒径，电位以及包封率;通过细胞摄取实验研究卵巢癌细胞(A2780)对普通脂质体（LP）和RGD修饰脂质体（RGDLP）的摄取效率。流式细胞仪检测不同载药脂质体诱导肿瘤细胞凋亡;构建卵巢癌裸鼠异位模型，考察不同载药脂质体对肿瘤生长抑制作用。结果RGDLP-PTX/Cu的粒径在（94.8±11.2）nm，电位为（-3±2.45）mV，PTX与Cu的包封率分别为81.8%和84.6%。细胞摄取实验结果显示，A2780细胞对RGDLP的摄取效率是LP的3.6倍;凋亡实验表明RGDLP-PTX/Cu诱导卵巢癌细胞凋亡的能力显著强于RGDLP-PTX、RGDLP-Cu和LP-PTX/Cu(P＜0.01);荷瘤裸鼠肿瘤生长抑制实验结果表明：RGDLP-PTX/Cu具有良好的抗卵巢癌作用(P＜0.01)。结论RGD修饰共载紫杉醇和姜黄素脂质体具有良好的卵巢癌细胞靶向性和抗卵巢癌作用，是一种潜在高效的卵巢癌靶向给药系统。

整合素受体;紫杉醇;姜黄素;脂质体

卵巢癌发病率居妇科恶性肿瘤发病率的第3位， 然而其死亡率却居首位[1]。晚期卵巢癌患者长期生存率仍不超过20%[2]。化疗是目前卵巢癌的重要治疗手段之一，患者的愈后在很大程度上取决于其对化疗的反应率。但是由于一般化疗药物具有极大的毒副作用，在杀灭肿瘤细胞的同时对正常细胞也有很大的影响，导致患者对化疗的顺应性低下，因此，我们需要一种新的治疗途径来提高病人的化疗顺应性并杀灭肿瘤细胞，靶向治疗便显得尤为重要。

靶向给药系统是指借助载体、配体或抗体将药物通过局部给药胃肠道、或全身血液循环而选择性地浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的给药系统[3]。脂质体是靶向给药系统的代表，它是由磷脂组成的具有双层膜结构的球形结构。脂质体具有良好的生物相容性，能够通过内核包载亲脂性药物和亲水性药物，脂质体还能够进行表面修饰，实现主动靶向[4]。有研究表明，卵巢癌细胞(A2780)表面有大量的整合素受体表达[5]，因此本研究将整合素受体特异性配体RGD连接到脂质体表面，以紫杉醇和姜黄素为模型药物构建了卵巢癌靶向给药脂质体，对其卵巢癌细胞靶向性以及对卵巢癌的治疗效果进行评价。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器 SizerNano ZS 90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪（英国Malvern instruments Ltd）。大豆磷脂（SPC，上海太伟药业有限公司）；DSPE-PEG 2000（美国Avanti polar lipids）；罗丹明标记磷脂（美国Avanti polar lipids）；DSPE-PEG 2000-MAL (美国Avanti polar lipids)；DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司）；紫杉醇（连云港恒瑞药业）；姜黄素（美国sigma）；胎牛血清（美国GIBCO公司）。人源卵巢癌细胞（A2780，上海细胞研究所)。

1.2 方法

1.2.1 RGD修饰共载紫杉醇和姜黄素脂质体的制备及其表征 参照文献[6-7]方法合成RGD-PEG 2000-DSPE.精密称取SPC 15.12 mg，胆固醇1.35 mg，DSPE-PEG 2000-OMe 1.25 mg，RGD-PEG 2000-DSPE 0.35 mg，紫杉醇0.30 mg，姜黄素0.25 mg，将以上材料和药物溶于氯仿中，在茄形瓶中减压蒸馏成膜，除去有机溶剂，置于真空干燥器中过夜，使其充分干燥，加入2 mL PBS水化，探头超声（80 W，10 s，10 s，5次）得到RGDLP-PTX/Cu。采用相同的方法制备RGDLP-PTX、RGD-LP-Cu、LP-PTX/Cu。用1.08 mg罗丹明标记的磷脂取代相同量的SPC制备罗丹明标记的荧光脂质体。参照文献[8-9]的方法测定紫杉醇和姜黄素的包封率。

1.2.2 A 2780卵巢癌细胞对RGD修饰脂质体的摄取 将对数生长期的细胞以5×105个/孔的密度接种于24孔板中，37℃培养24 h后，每孔加入适量不载药LP和RGDLP使孔中罗丹明浓度为0.15 nmol/mL，37℃分别孵育2 h和4 h后除去含脂质体培养基，冷PBS清洗2次，每孔加入1%triton，裂解细胞，暗处放置30 min，用荧光分光光度计测定荧光值。为了定性观察细胞对脂质体的摄取，将脂质体与细胞共同孵育4 h后，将细胞用PBS漂洗3次，加入2µg/mL DAPI溶液，室温孵育30 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦显微镜观察细胞摄取。

1.2.3 RGD修饰共载紫杉醇和姜黄素脂质体诱导A2780细胞凋亡 为了定量检测不同脂质体引起的肿瘤细胞凋亡，培养A 2780细胞接种于6孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的脂质体，使每孔的最终脂质浓度为6.5µmol/mL。将孔板移入37℃CO2孵箱中培养后24 h收集细胞，用冰PBS清洗细胞3次，FITC/PI双染，细胞避光放置15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 卵巢癌异位肿瘤模型的构建及其抗肿瘤研究

A2780细胞经胰酶消化，离心后将其悬浮于DMEM培养液中，计数调节浓度至5×107个/mL。取4～6周龄，体重20～25 g的雌性裸鼠，将准备好的A2780细胞悬浊液皮下接种于裸鼠背部，每只裸鼠接种0.1 mL细胞悬浊液。接种后1～2周可见背部长出肿瘤块，证明接种成功。

将优选后的50只荷瘤裸鼠随机分为5组，每组10只，分别为RGDLP-PTX组、RGDLP-Cu组、LP-PTX/Cu组、RGDLP-PTX/Cu组和生理盐水组。荷瘤裸鼠每天观察其活动度和饮食习惯，第21天后剖肿瘤，称重，计算抑瘤率。

1.3 统计学方法 实验数据以“x±s”表示，SPSS 21.0统计软件进行数据分析，2组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂质体的表征 取制备得到的RGDLP-PTX/Cu用马尔文激光粒度仪测定粒度和zeta电位，平行测定3次。结果显示RGDLP-PTX/Cu的平均粒径为（94.8±11.2）nm，多分散性系数为0.12，粒度分布见图1。平均zeta电位为（-3±2.45）mV。PTX与Cu的包封率分别为81.8% 和84.6%。

2.2 RGDLP的体外肿瘤细胞摄取实验 在A2780细胞表面整合素受体高度表达。细胞摄取的定量实验结果（见表1）显示：A2780细胞对RGDLP摄取效率是普通脂质体的3.6倍。由于测得荧光值为扣除空白后的细胞内荧光值，因此，本研究采用细胞内荧光强度表示摄取效率。定性的激光共聚焦荧光显微镜观察结果（见图2）所示，RGDLP组荧光强度显著强于普通脂质体，这与定量的实验结果相一致。

图1 RGDLP-PTX/Cu的粒径分布图Fig.1 The diagram of size of RGDLP-PTX/Cu

表1 A 2780细胞对不同脂质体的摄取效率（n=3）Tab.1 Uptake of different liposomes by A 2780 cells (n=3)

图2 激光共聚焦观察A 2780细胞对罗丹明标记脂质体的摄取.Fig.2 Uptake of rhodamine labelled liposomes by A 2780 cells based on confocal laser scanning microscopy

2.3 RGDLP-PTX/Cu诱导A2780细胞凋亡 肿瘤细胞凋亡实验结果显示，RGDLP-PTX/Cu组、RGDLP-PTX组、RGDLP-Cu组和LP-PTX/Cu组诱导肿瘤细胞凋亡率为54.8%、39.7%、21.5%和23.7%，而生理盐水组早期凋亡率为0.58%。与生理盐水组相比，RGDLP-PTX/Cu组、RGDLPPTX组、RGDLP-Cu组和LP-PTX/Cu组均能诱导肿瘤细胞凋亡，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与RGDLP-PTX组、RGDLP-Cu组和LP-PTX/Cu组相比，RGDLP-PTX/Cu能够增加肿瘤细胞凋亡，差异具有统计学意义（P＜0.01，见图3）。

图3 不同载药脂质体诱导肿瘤细胞凋亡率**P＜0.01， 与RGDLP-PTX组、RGDLP-Cu组和LP-PTX/Cu组相比；△P＜0.01，与生理盐水比较Fig.3 The effect of drugs induced cells apoptotic**P＜0.01，Compared with RGDLP-PTX group， RGDLP-Cu group and LP-PTX/Cu group；△P＜0.01，Compared with saline group

2.4 RGDLP-PTX/Cu对卵巢癌异位瘤的生长抑制作用 荷瘤裸鼠治疗实验以生理盐水组为对照，RGDLP-PTX/ Cu组、RGDLP-PTX组、RGDLP-Cu组和LP-PTX/Cu组对肿瘤生长的抑制率分别为（71.4±7.5）%、（52.5±7.2）%、（19.3±3.3）%和（33.7±4.9）%，RGDLP-PTX/Cu组与其他组间差异具有统计学意义（P＜0.01，见表2）。

表2 不同药物干预对肿瘤生长的抑制率（n=5）Tab. 2 The effect of different drugs inhibit the growth of tumor (n=5)

3 讨论

紫杉醇是来源于红豆杉属太平紫杉的一种细胞毒性物质，被广泛用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤和非小细胞肺癌的治疗[10]。紫杉醇难溶于水及多种药用溶媒，目前国内外多采用聚氧乙基代蓖麻油与无水乙醇作为混合溶剂制成注射剂，常常导致严重的过敏反应，从而使紫杉醇的临床应用受到一定的限制。姜黄素是从中药姜黄中提取的活性成分。近年来姜黄素被广泛用于抗前列腺癌[11]、肝癌[12]、脑胶质瘤[13]、结肠癌[14]以及卵巢癌[15]的治疗研究。理想的肿瘤靶向药物传递系统不仅需要在全身给药后将药物浓集在肿瘤组织，而且还需要将药物高效地传递到肿瘤细胞内，从而将治疗作用最大化并减少抗肿瘤药物的副作用。肿瘤组织内部由于血管壁间隙较宽、结构完整性差、淋巴回流缺失，造成纳米颗粒在此具有选择性高通透性和滞留性，这种现象被称作肿瘤组织的高通透性和滞留效应（Enhanced permeability and retention effect），简称EPR效应[16-17]。有研究证实，肿瘤表面和内皮血管表面都大量表达了整合素受体α v β 3[14]，RGD是一种能够与整合素受体特异性结合的环状三肽，本研究将RGD连接到包载紫杉醇和姜黄素的脂质体表面，靶向抑制卵巢癌。目前鲜见共载紫杉醇和姜黄素药物载体系统的报道。

本研究显示，制备得到的脂质体的粒径为95 nm左右，紫杉醇和姜黄素的包封率都大于80%。经过RGD修饰后能够显著增强A2780卵巢癌细胞对脂质体的摄取。定性的细胞摄取实验也与定量的实验结果一致。细胞毒性实验结果显示，结果RGD修饰后共载药脂质体对A2780卵巢癌细胞的细胞毒性强于未修饰的共载药脂质体，这与细胞摄取实验结果相一致，这说明RGD修饰的载药脂质体的细胞增殖抑制作用依赖于细胞对脂质体的摄取，经过RGD修饰后，肿瘤细胞对脂质体的摄取增强，细胞毒性增强。共载药脂质体的细胞毒性强于紫杉醇脂质体和姜黄素脂质体，这说明，紫杉醇和姜黄素的共载能够有效发挥两者药物抗肿瘤的协同作用。综上所述，本研究制备的RGD修饰共载紫杉醇和姜黄素脂质体是一种潜在有效的卵巢癌细胞靶向给药系统。

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The study of RGD modi fi ed paclitaxel and curcumin loaded liposome for the treatment of ovarian carcinoma in vitro and in vivo

ZHANG Xiao-wen1, WU Jing1,2
（1. Jiaozuo Maternal and Child Care Service Center of Henan Province, Jiaozuo 454000, China; 2 . The Third Clinical Medical School of Jilin University，Changchun 130000, China）

ObjectiveTo prepare RGD conjugated paclitaxel and curcumin loaded liposome and evaluate their properties and effect on the treatment of ovarian carcinoma in vitro and in vivo 。MethodThe liposomes were prepared by thin fi lm hydration method. The particle size，Zeta potential and entrapment ef fi ciency were evaluated. The ef fi ciency of cellular uptake on A 2780 cells in vitrowas evaluated. Flowcytometry were used to observe the apoptosis morphous.A 2780 cells werexenografted in athymic mice to establish the animal model, which were used to evaluate the effect of anti-cancer。ResultsThe particle diameter of the RGDLP-PTX/Cu was (94.8±11.2) nm with the Zeta potential of (-3±2.45) mV. The entrapment ef fi ciency of PTX and Gen were 81.8% and 84.6% respectively. The result demonstrated that RGDLP uptaken by A 2780 were 3.6 times higher than that of LP. The apoptosis assay、the inhibition of the inhibition of tumor in vivocon fi rmed strong inhibitory effect ofRGDLP-PTX/Cu。ConclusionRGDLP-PTX/Cu were easy to prepare and it is a potential delivery system for the treatment of ovarian carcinoma.

integrin receptor；paclitaxel；curcumin；liposome

R 943

A

1005-1678(2014)01-0062-03

张小文，男，副主任药师，研究方向：药物新剂型与新制剂，Email：529827419@qq.com。