补中益气汤对A 5 4 9荷瘤小鼠脾脏上Caspase-3蛋白表达影响研究

王雨，刘春英

(辽宁中医药大学 研究生院，辽宁 沈阳 110032)

补中益气汤对A 5 4 9荷瘤小鼠脾脏上Caspase-3蛋白表达影响研究

王雨，刘春英△

(辽宁中医药大学 研究生院，辽宁 沈阳 110032)

目的研究补中益气汤对半胱氨酸天冬氨酸酶-3（Caspase-3）在人肺腺癌细胞株(A 549)荷瘤小鼠脾脏上表达的影响。方法随机对照法将24只A 549荷瘤BALB/c小鼠分为空白对照组，补中益气汤低剂量组、补中益气汤高剂量组，顺氯氨铂（cisplatin,DDP）组；补中益气汤每日给药2次连续10天，顺铂每日给药1次连续3天，在连续15天后将所有荷瘤小鼠的脾脏取出。将新鲜的脾脏组织固定后制作石蜡切片。免疫组织化学法检测各组脾组织中Caspase-3蛋白表达的部位与含量多少；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 检测各组组织中Caspase-3 mRNA的表达。结果免疫组化结果显示与空白对照组相比，补中益气汤低剂量组Caspase-3蛋白的表达量显著增多(P＜0.05)，补中益气汤高剂量组蛋白的表达量增多(P＜0.05)。而DDP组与空白对照组相比无统计学意义，DDP组与补中益气汤低剂量组、补中益气汤高剂量组相比的差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。RT-PCR结果同免疫组化结果具有一致性。结论补中益气汤可增加A 549荷瘤小鼠脾脏上Caspase-3蛋白的表达，从而使Caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡的作用增强。

人肺腺癌细胞株；半胱氨酸天冬氨酸酶-3；补中益气汤；脾脏

肺癌在我国是常见的恶性肿瘤之一。当今的21世纪肺癌已成为第一大恶性肿瘤，在常见的恶性肿瘤中肺癌的发生率及死亡率居于首位[1]。肺癌是受多因素影响多基因参与的一类复杂性呼吸系统疾病，其病因与发病机制至今尚未明确。且男女性别差异和城乡差别逐渐缩小，平均发病年龄逐年升高[2-3]。Caspase-3蛋白是介导细胞凋亡的一种蛋白水解酶，即Caspase家族中的关键效应酶，是执行细胞凋亡的重要效应分子，广泛表达于正常人体组织及多种肿瘤组织中[4-6]。脾为人体最大的免疫器官，可以提高肺癌患者的免疫力[7-8]。研究表明补中益气汤对肺与脾的补益作用符合“培土生金”的治疗原则，且有治疗肺癌所需的扶正固本、益气补血、健脾补肺等功能，达到“扶正驱邪”的目的，能增加体内Caspase-3蛋白的表达从而诱导肿瘤细胞凋亡[9-11]。但补中益气汤增加Caspase-3蛋白表达的作用机制尚不明确。本研究将通过体外实验来探讨补中益气汤对人肺腺癌细胞株A549荷瘤小鼠脾脏上Caspase-3蛋白表达的影响，为补中益气汤在治疗肺癌的临床应用上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 人肺腺癌细胞株A 549由中国医科院肿瘤研究中心细胞库提供。雌性SPF级BALB/c小鼠[动物许可证号：scxk(京)2011-0011，体重9～11 g]购自北京维通利华实验动物技术有限公司；RIPA裂解液购于北京鼎国生物技术有限公司(批号：WB-0071)；荧光定量PCR仪购于ABI公司。Caspase-3多克隆抗体(博奥森)；药物顺铂注射液购于山东齐鲁医药有限公司(批号：2030132 DB)。

1.2 补中益气汤煎剂的制备 以“人和动物按体表面积折算等效剂量比值表”为计算原则，并根据人民卫生出版社出版的《现代临床方剂学》中规定的补中益气汤用药剂量(黄芪18 g，白术9 g，陈皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，人参6 g，甘草9 g，当归身3 g)，以及临床常用剂量计算出小鼠用药的等效剂量，分别设高、低剂量组，即5.82 g/kg（生药）、1.46 g/kg（生药），常规煎煮3次，煎至最终浓度为每毫升含生药2.33 g浓缩成1 kg/L的补中益气汤煎剂，放入4℃冰箱保存备用。

1.3 动物分组与处理 用随机数字表法将24只BALB/c小鼠随机分成4组，每组6只。实验分组为：空白对照组、补中益气汤低剂量组、补中益气汤高剂量组、DDP组。荷瘤方法是在小鼠腋下均注射A549细胞悬液0.2 mL（密度为2×108/L），5 d后观察小鼠腋下是否有米粒状突起物，如果小鼠腋下出现米粒状突起物，随即开始用药。空白对照组：每只小鼠0.5 mL的生理盐水灌胃，每天2次，连续10 d；补中益气汤低剂量组：每只小鼠0.5 mL的低剂量补中益气汤灌胃，每天2次，连续10 d；补中益气汤高剂量组：每只小鼠0.5 mL的高剂量补中益气汤灌胃，每天2次，连续10 d；DDP组：注射DDP的剂量和方法是顺铂腹腔注射，l.38 mg/m2，每天1次，连续3 d。以上所有小鼠于给药15 d后处死并且取出脾脏，4℃冰箱保存备用。

2 实验方法

2.1 免疫组织化学 采用免疫组织化学SABC法（亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法）先将脾组织石蜡切片放置于玻片架上在干燥箱中以56℃烘烤40 min，之后将石蜡切片放置于染色缸中分别用二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各浸泡15～30 min）脱蜡和下行梯度乙醇（浸泡无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、90%、80%及70%乙醇各2 min）水化，用PBS缓冲液冲洗5 min×3次后放置蒸馏水中待用。用温度达到92℃以上的水浴箱对组织抗原Caspase-3蛋白进行40 min加热修复，PBS冲洗3 min×3次后0.3%TritonX-100（PBS稀释30%TritonX-100，现用现配）中室温浸泡25 min打孔细胞膜，用PBS冲洗5 min×3次后蒸馏水配制新鲜3%H2O2（蒸馏水稀释30%H2O2，现用现配）室温浸泡10 min灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗5 min×3次后每张切片滴加50µL正常山羊血清封闭液（与二抗同种动物来源的血清），室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗。每张切片滴加按1∶100或1∶500比例稀释的一抗（Rb a Caspase-3）50µL～100µL，4℃冰箱过夜或37℃孵育2 h，PBS冲洗5 min×3次。每张切片滴加兔IgG-免疫组化试剂盒（SABC即用型试剂盒）中羊抗兔IgG-Biotin一滴，37℃孵育20 min，PBS冲洗3 min×3次。每张切片滴加SABC即用型试剂盒中SABC液一滴，37℃孵育20 min，PBS冲洗3 min×3次。室温配置DAB溶液（现用现配）显色，白色纸张作衬5～10 min内组织显示为淡棕色时或者显微镜下控制显色程度直至其呈现最合适的免疫反应阳性效果后用蒸馏水洗涤终止显色。苏木素复染5～10 s，自来水返蓝，流水冲洗40 min，上行梯度乙醇（70%、80%、90%、95%及无水乙醇）脱水各2 min和二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各10 min，中性树脂胶水封片，显微镜下观察。

2.2 PCR检测各组脾组织中Caspase-3 mRNA的表达采用Trizol一步法，提取总RNA，逆转录成cDNA。Caspase-3引物序列：上游引物5-GTCCCACTGTCTGTCTCA-3 PIE，下游引物3-GAATGTCATCTCGCTCTG-5；内参序列：上游引物5′-CCAACCGTGAAAAGATGACC-3′，下游引物5′-CAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′；长度为498 bp，预变性94℃ 1 min， 退火60℃ 1 min，延伸72℃ 2 min，循环35次。

2.3 统计学方法 采用SPSS Stastistics 17.0数据编辑器统计学软件对数据进行处理，实验数据以“x±s”表示，组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 补中益气汤对各组脾组织上Caspase-3蛋白表达的影响 结果显示，空白对照组中Caspase-3蛋白在细胞浆和细胞核中均无表达；补中益气汤低剂量组与空白对照组相比，胞浆中明显出现棕黄色颗粒，表明Caspase-3蛋白的表达量明显增加(P＜0.05)；Caspase-3蛋白的表达量随着补中益气汤剂量的增加而明显增多，补中益气汤高剂量组与空白对照组相比胞浆中出现大量较大的棕黄色染色颗粒，与补中益气汤低剂量组相比胞浆中大量出现的棕黄色颗粒明显成片，Caspase-3蛋白的表达量显著增多(P＜0.05)。而DDP组与空白对照组相比，Caspase-3蛋白的表达量少量增多，但无统计学意义。DDP组Caspase-3蛋白的表达量与补中益气汤低剂量组、补中益气汤高剂量组相比的差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，见图1、图2)。

图1 补中益气汤对各组脾细胞中Caspase-3蛋白表达量的影响（免疫组织化学法)(×400)A.空白对照组；B.补中益气汤低剂量组（1.46 g·kg-1）；C.补中益气汤高剂量组(5.82 g·kg-1）；D.DDP组Fig.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction on the expression of Caspase-3 protein in every group(Immunohistochemical method)(×400）A. Control group；B. Low-dose group（1.46 g·kg-1）；C. High-dose group（5.82 g·kg-1）；D. DDP group

图2 补中益气汤对各组脾细胞中Caspase-3 AOD表达量的影响*P＜0.05，与空白对照组相比；△P＜0.05，与补中益气低剂量组相比；##P＜0.01，与补中益气高剂量组相比Fig.2 Effect of Buzhong Yiqi Decoction on the expression of Caspase-3 AOD in every group*P＜0.05，compared with control group；△P＜0.05， compared with low-dose group；##P＜0.01，compared with high-dose group

3.2 补中益气汤对各组脾组织上Caspase-3 mRNA表达的影响 与空白对照组相比，补中益气汤低剂量组Caspase-3 mRNA的表达显著增加(P＜0.01)。随着补中益气汤剂量的增加，脾细胞上Caspase-3 mRNA的表达也增多。与空白对照组相比，补中益气汤高剂量组Caspase-3 mRNA的表达显著增加(P＜0.05)，并且与低剂量组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。而DDP组Caspase-3 mRNA的表达与空白对照组相比无显著差异，与补中益气汤低剂量组、补中益气汤高剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。将RT-PCR检测结果进行单因素方差分析，同空白对照组相比，补中益气汤低剂量组，补中益气汤高剂量组和DDP组与之的差异均有统计学意义（P＜0.05，见图3）。

图3 补中益气汤对各组脾细胞中Caspase-3 mRNA表达量的影响*P＜0.05，*P＜0.01，与空白对照组相比；△P＜0.05，△△P＜0.01，与补中益气低剂量组相比；##P＜0.01，与补中益气高剂量组相比Fig.3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction on the expression of Caspase-3 mRNA in every group*P＜0.05，*P＜0.01，compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with low-dose group；##P＜0.01，compared with highdose group

4 讨论

我国人口老龄化现状导致肺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，因此肺癌是影响我国居民健康的主要恶性肿瘤，必须采取积极有效的防治措施[12]。根据组织学分类，肺癌中的肺腺癌属于一种非小细胞癌，目前在临床上针对于肺腺癌的常用治疗方法包括手术、化疗、放疗等等。长期以来，常规西医诊疗方法在对抗肿瘤的同时也不可避免地产生了一些不良反应。既往大量研究表明，Caspase-3蛋白与细胞凋亡密切相关[13-15]，且中药可通过调节脾的免疫功能从而对肿瘤产生抑制作用[16]。

本实验以A549荷瘤小鼠的脾组织作为研究对象，研究补中益气汤对荷瘤小鼠脾脏上Caspase-3蛋白表达的影响，并检测补中益气汤对脾脏上Caspase-3蛋白基因表达的影响。通过实验发现：补中益气汤可使A549荷瘤小鼠脾脏上Caspase-3蛋白的表达量增加，并呈现剂量依赖性——剂量越高Caspase-3蛋白的表达量越大。其对于耐顺铂肺腺癌患者脾细胞上Caspase-3蛋白的表达也有一定影响，表明祖国医学传统方剂补中益气汤能缓解肺腺癌患者对于顺铂的耐药性，提高治疗药物对肿瘤的作用，并且有研究证实中医药针对于现代医学治疗手段下的耐药肺腺癌患者具有一定的临床疗效[17-18]。但是尚不明确补中益气汤是否能完全逆转肺腺癌患者对于化疗的耐药性。另外对Caspase-3蛋白的基因检测表明，补中益气汤能使Caspase-3蛋白mRNA的表达量增多，且表达量与补中益气汤的剂量呈正相关。本研究表明，低剂量和高剂量的补中益气汤均可增加肺腺癌患者脾脏上Caspase-3蛋白的表达，且高剂量的补中益气汤可使其表达更明显，从而诱导肿瘤细胞的凋亡，达到缓解或治疗肺腺癌的目的。

截止到目前，已有大量实验研究表明现代医学手段联合中药能更好地改善或治疗肿瘤，特别是对于恶性肿瘤有明显的临床疗效，并且可以减低现代医学手段带来的毒副作用[19-20]。例如有实验研究发现，槲皮素可通过诱导Caspase-3蛋白的表达而起到诱导A549肿瘤细胞凋亡的作用[21]。本实验研究可为临床上治疗肺腺癌的个体化合理方案提供理论参考，从而将中医药与现代医学手段有效结合起来。但是补中益气汤增强肺腺癌患者脾脏上Caspase-3蛋白表达的具体机制还有待于进一步研究。

[1] 杨玲，李连弟，陈育德，等.中国肺癌死亡趋势分析及发病、死亡的估计与预测[J].中国肺癌杂志，2005，8(4)：274-278.

[2] 王强修，李钧，朱良明.肺癌诊断与治疗[M].北京：人民军医出版社，2013:16.

[3] 韩仁强，郑荣寿，张思维，等.1989年-2008年中国肺癌发病性别、城乡差异及平均年龄趋势分析[J].中国肺癌杂志，2013，16(9)：445-451.

[4] Hishikawa K,NakakiT,FujiiT.Connective tissue growth factor induce apoptosis via Caspase-3 in culturel human aortic smooth muscle cells [J].Eur J Pharmaco,2000,392(1-2):19-22.

[5] Sykes MC,Mowbray AL,Jo H.Reversible Glutathiolation of caspase-3 by glutaredoxin as a novel redox signaling mechanism in tumor necrosis Factorα-InducedCellDeath[J].Cir Res,2007,100(2):152-154.

[6] Kageaki Kuribayashi,Patrick A.Mayes,Wafik S.El-Deiry.What are Caspases 3 and 7 Doing Upstream of the Mitochondria?[J].Cancer Biology and Therapy,2006,5(7):763-765.

[7] 陈丹丹，宋亮，刘丽娟.黄芪多糖对肺气虚小鼠免疫调节作用[J].陕西中医学院学报，2007，30(3)：35-37.

[8] 郑红刚，朴炳奎，花宝金，等.肺瘤平膏及其拆方对Lewis肺癌小鼠树突状细胞影响的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2010，30(12)：1288-1291.

[9] 李自全，蔡伦华，吴万梅，等.甘温除热法在肿瘤发热中的应用[J].四川中医，2008，26(7)：61.

[10] 张霆.扶正法治疗肺癌刍议[J].江西中医药，2007，38(291)：52-53.

[11] 高天舒，韩晓晴，尹慧丝.补中益气汤对甲状腺功能减退大鼠心肌细胞凋亡及Fas、Fasl和Caspase-3蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(10)：236-239.

[12] 陈万青，张思维，邹小农.中国肺癌发病死亡的估计和流行趋势研究[J].中国肺癌杂志，2010，13(5)：488-493.

[13] 王艳，宋英，买玲.Survivin、Caspase-3和Bcl-2在肺癌中的表达及意义[J].中国癌症杂志，2009，19(1)：25-28.

[14] 王靖华，陈龙邦，黄文斌，等.Survivin和Caspase-3在非小细胞肺癌中的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系[J].中国肺癌杂志，2005，8(5)：435-438.

[15] 李承慧，胡冰，王晓秋，等.非小细胞肺癌中Caspase-3、Survivin、K-ras的表达及其意义[J].中国肺癌杂志，2008，11(1)：90-95.

[16] 于明薇，孙桂芝，吴洁，等.黄芪、苏木及其组方对荷瘤小鼠脾调节性T细胞表达及血清细胞因子水平的干预作用[J].北京中医药大学学报，2010，33(4)：241-245.

[17] 农丽，伍钢，戴晓芳，等.吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株A 549/DDP耐药机制的实验研究[J].临床肿瘤学杂志，2010，15(6)：487.

[18] 胡硕，胡成平，梁昌华，等.人参单体Rh2对肺腺癌耐药细胞促凋亡作用的研究[J].湖南中医学院学报，2005，25(2)：14-16.

[19] 胡强，汪宏云，杨勇刚.补中益气汤防治晚期肺癌化疗毒副反应临床观察[J].实用中医药杂志，2008，24(5)：271-272.

[20] 刘明，薛芳芳.化疗联合补中益气汤加减治疗中晚期非小细胞肺癌30例[J].湖南中医杂志，2013，29(5)：42-44.

[21] 闻春生，应斌武，张永刚，等.槲皮素对肺腺癌细胞株A549细胞中凋亡相关因子Caspase-3表达的影响[J].中国肺癌杂志，2008，11(2)：194.

Effect of Buzhong Yiqi Decoction on the expression of Caspase-3 protein of A549 tumor-bearing mice’spleen

WANG Yu,LIU Chun-YingΔ
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Faculty of Graduate Studies,Shenyang 110032,China)

ObjectiveTo analyses the effect of Buzhong Yiqi Decoction on the expression of Caspase-3 in human lung adenocarcinoma cells (A 549) tumor-bearing mice’spleen。Method24 BALB/c mice were randomly divided into the control group(given saline),low-dose and high-dose Buzhong Yiqi Decoction groups,cisplatin(DDP)group；Buzhong Yiqi Decoction was administered twice daily for 10 days consecutively and DDP was administered once daily for 3 days consecutively, after 15 days was the spleens of all tumor-bearing mice were obtained.The expression of Caspase-3 protein and Caspase-3 mRNA in every group were detected by immunohistochemical method seperately and polymerase chain reaction method seperately。ResultsCompared with control group,the result of immunohistochemistry showed that the expression of the Caspase-3 protein in Buzhong Yiqi Decoction low-dose group and high-dose group were both ssigni fi cantly increased (P＜0.05). The differences hetween DDP group and control group was not signi fi cant, but the differences between DDP sroup and Buzhong Yigi Decoction Low-dose sroup and hishdoe group were signi fi cant (P＜0.05, P＜0.01).The result of RFPCR was accordance with the result of immunohisto chemistry。ConclusionBuzhong Yiqi Decoction can increase the expression of Caspase-3 protein in A549 ctumor-bearing mice’spleen,and promote the Caspase-3’s inducing effect on tumor cell apoptosis.

A549;Caspase-3;Buzhong Yiqi Decoction;spleen

R 285.5

A

1005-1678(2014)01-0019-03

辽宁省自然基金资助项目（20102145）

王雨，女，硕士在读，研究方向：中药干预肿瘤细胞凋亡，Email：63 wym@sina.com。刘春英，通信作者，女，教授，博士生导师，研究方向：中药抗肿瘤作用机制研究，Email：chunying 99@163.com。