抑制剂对黑鸡心葡萄多酚氧化酶活性的影响

郭艳萍，刘美林，贺东亮，赵金安

(太原工业学院 环境与安全工程系，山西 太原 030008)

抑制剂对黑鸡心葡萄多酚氧化酶活性的影响

郭艳萍，刘美林，贺东亮，赵金安

(太原工业学院 环境与安全工程系，山西 太原 030008)

研究了不同浓度梯度的亚硫酸氢钠、柠檬酸、EDTA、抗坏血酸4种抑制剂对清徐黑鸡心葡萄多酚氧化酶(PPO)活性的抑制效果，旨在单因素试验的基础上，通过正交试验进一步优化黑鸡心葡萄在贮藏、运输过程中防褐变添加剂的配方。结果表明：柠檬酸、EDTA、抗坏血酸对PPO活性表现出较好的抑制效果，3种抑制剂联合作用的最佳组合为A1B2C2，即柠檬酸0.04 mmol·L-1，EDTA0.08 mmol·L-1，抗坏血酸0.08 mmol·L-1。PPO 活性的抑制率达到85.67%。

清徐黑鸡心葡萄；多酚氧化酶；活性；抑制剂

黑鸡心葡萄是山西清徐特有的葡萄品种，果穗大，果粒密实，形似鸡心，色泽黑紫。果肉呈淡绿色且柔软多汁，含糖量17%左右，含酸量1.5%左右，果实可以生食、制汁、制酱、制果醋。在黑鸡心葡萄加工、贮运过程中，酶促褐变是主要的难题之一。酶促褐变的发生由多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶等引起，其中发挥主要作用的是多酚氧化酶。

多酚氧化酶属严格的质体酶，由核基因编码，多基因调控，参与生物氧化，是一种含Cu2+的末端氧化酶。在PPO的作用下组织中的酚类物质被氧化成醌类物质，醌可在无酶参与的条件下被氧化或者自身聚合形成黑色素。目前，研究抑制酶促褐变的方法主要有加热、高压、CO2冷处理、磁场作用、添加PPO酶活抑制剂等[1～3]，其中最经济最有效的方法当数添加PPO酶活抑制剂。已有学者研究不同抑制剂在果蔬保鲜中的作用[4]，但由于清徐黑鸡心葡萄为地方特有品种，鲜见有关黑鸡心葡萄中PPO的研究报道，因此，本文旨在研究不同抑制剂对清徐黑鸡心葡萄PPO活力的影响，通过正交试验筛选出最佳复合抑制剂组合，为黑鸡心葡萄的加工、运输及贮藏及控制酶促褐变提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清徐黑鸡心葡萄(取自清徐县徐沟镇果园)；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、邻苯二酚、亚硫酸氢钠、EDTA-Na2、柠檬酸、抗坏血酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平、Thermo数显pH仪、紫外可见分光光度计、TGL-16G-C高速冷冻离心机、电热恒温水浴锅。

1.3 试验方法

1.3.1 黑鸡心葡萄PPO酶液的制备[5]

称取100 g洗净晾干的黑鸡心葡萄，加入4℃ pH6.8 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液300 mL，快速匀浆，在4℃，4000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液即为PPO粗酶液,放置于4℃冷藏保存。

1.3.2 黑鸡心葡萄PPO酶活性的测定[6]

取磷酸缓冲液3.5 mL、0.1 mol·L-1的邻苯二酚溶液1 mL和PPO 粗酶液0.5 mL，摇匀，30℃恒温水浴15 min。在300～600 nm波长范围进行波普扫描，确定PPO 粗酶作用产物的最大吸收波长(λmax=430nm)并计算PPO活力。加入PPO酶液开始计时，每隔20 s测定一次λmax处的光吸收值，测定3 min，以每分钟样品吸光度值增加0.001为1个酶活力单位(U)。

1.3.3 不同抑制剂对黑鸡心葡萄PPO酶活性的抑制

以0.01 mol·L-1磷酸缓冲液6 mL、PPO酶液1mL、0.1 mol·L-1邻苯二酚2 mL为反应体系，分别加入不同浓度梯度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mmol·L-1)亚硫酸氢钠、EDTA、柠檬酸、抗坏血酸1 mL为抑制剂，计算不同抑制剂对PPO活性的抑制率, 分析不同浓度抑制剂与黑鸡心葡萄PPO活性的抑制关系。各种抑制剂取3组平行样本，做2次重复试验。

1.3.4 正交试验筛选最佳复合抑制剂组合

在1.3.3单因素分析结果组间显著性差异用t检验，在此基础上，以抑制剂为因素，3组抑制浓度为水平做正交试验，考察抑制剂联合抑制效果，最终确定最佳复合抑制剂组合。

2 结果与分析

2.1 不同浓度亚硫酸氢钠对黑鸡心葡萄PPO活性的影响

研究表明亚硫酸氢钠对酶的抑制作用主要体现于SO2对酶有直接抑制作用，同时它具有还原作用，可将中间产物邻苯二醌不可逆地还原为无色物质；另外，其还可与羰基加成，防止了羰基化合物的进一步聚合[7]。不同浓度亚硫酸氢钠对黑鸡心葡萄PPO活性的影响见图1。从图中可看出随着亚硫酸氢钠浓度的增加，其对酶活性的抑制率也逐步增加，浓度达到0.08 mmol·L-1时抑制率达到最大值30%，且较其余浓度的抑制效率均有统计学差异。浓度超过0.08 mmol·L-1时抑制率下降，对酶活力的抑制作用下降。

图1 亚硫酸氢钠对黑鸡心PPO活性的影响

2.2 不同浓度柠檬酸对黑鸡心葡萄PPO活性的影响

柠檬酸对PPO的抑制作用体现在一方面提供酸性环境使PPO偏离其最适pH，另一方面柠檬酸分子中所含的3个羧基能与酶分子中的铜离子发生鳌合，从而使酶失活[7]。不同浓度柠檬酸对黑鸡心葡萄PPO活性的影响见图2。当柠檬酸浓度在0.01～0.06 mmol·L-1范围内，随着抑制剂浓度的增加，酶活性降低较快，柠檬酸浓度超过0.06 mmol·L-1后，酶活性降低速率放缓，0.08 mmol·L-1酶活性抑制率为72%，达到最大值，且较其余浓度的抑制效率均有统计学差异。抑制剂浓度继续增大，抑制率稍有降低，但变化不大。

2.3 不同浓度EDTA对黑鸡心葡萄PPO活性的影响

EDTA可与PPO中铜离子发生配位反应从而抑制酶活性[4～7]。不同浓度EDTA对黑鸡心葡萄PPO活性的影响见图3。当EDTA浓度为0.01～0.06 mmol·L-1时，对酶活力的抑制率呈上升增长趋势，当浓度为0.08 mol·L-1时，酶活力抑制率出现最大值77.6%，且较其余浓度的抑制效率均有统计学差异。超过0.08 mmol·L-1时 ，其对酶活力的抑制率反而降低。各组平行试验均呈显著性差异。

图2 柠檬酸对黑鸡心PPO活性的影响

图3 EDTA对黑鸡心PPO活性的影响

2.4 不同浓度抗坏血酸对黑鸡心葡萄PPO活性的影响

抗坏血酸对PPO反应体系有多重作用，它既可将O-醌还原成O-二羟基酚，又可螯合Cu2+，甚至可以被PPO直接氧化，体现出竞争性抑制[7,8]。由图4可见，不同浓度抗坏血酸对黑鸡心葡萄PPO活性的影响见图4。当抗坏血酸浓度由0.01 mmol·L-1上升至 0.08 mmol·L-1时，PPO酶活被显著抑制，抑制率由15%大幅增长至74%。随着抑制剂浓度增加，抑制率并未增加反而略有降低。不同浓度的各组平行试验均呈现出显著性差异。

2.5 复合抑制剂对黑鸡心葡萄PPO活性的影响

单一抑制剂的抑制实验结果表明，亚硫酸氢钠、EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、对黑鸡心葡萄PPO均有一定的抑制作用，其中柠檬酸、EDTA与抗坏血酸的抑制效果较好，亚硫酸氢钠的抑制率较低。因此，采用L9(33)正交试验(表1)分析由它们组成的复合抑制剂对PPO活性的联合抑制效果。结果见表2。

图4 抗坏血酸对黑鸡心PPO活性的影响

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验表

由表2可见，根据极差分析，三因素中对黑鸡心PPO活性的抑制作用：抗坏血酸gt;EDTAgt;柠檬酸，通过正交实验得出的复合抑制剂优化组合：A1B2C2，即柠檬酸0.04 mmol·L-1，EDTA0.08 mmol·L-1，抗坏血酸0.08 mmol·L-1。在此条件下测得复合抑制剂对黑鸡心多酚氧化酶的抑制效果最佳，抑制率达到85.67%。

3 讨论

随着多酚氧化酶研究的不断深入，它的作用机理逐渐明确、应用范围逐步扩大。多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要原因，它促使酚类物质氧化生成黑色素，严重影响了果蔬的营养、风味和外观品质。[8,9]

目前，常用的防止酚类物质褐变的方法主要有两种：一是用EDTA等酚类物质的螯合剂，或乙醇、丙酮等有机溶剂将酚溶解[4～6]，通过离心而将酚类物质除去；二是向提取液中加入VC等抗氧化剂[10]。

本文采用了亚硫酸氢钠、抗坏血酸、EDTA和柠檬酸四种单一抑制剂对研究清徐黑鸡心葡萄的多酚氧化酶活性。结果显示亚硫酸氢钠抑制效果较差，与庞凌云等[11]的报道有所差异，究其原因可能是黑鸡心葡萄自身的酸度较大，抑制了亚硫酸氢钠水解产生SO2，降低了其对PPO的抑制作用。本研究中抗坏血酸呈现出对PPO活性较强的抑制作用，另一方面其又是食品营养强化剂[12]，在降低褐变的同时又补充了人们所需的营养物质，因此，以抗坏血酸为主要成分的PPO复合抑制剂在果蔬保鲜上有广泛的应用前景。

4 结论

4种抑制剂中EDTA对清徐黑鸡心葡萄多酚氧化酶活性效果最好(添加0.08 mmol·L-1浓度的EDTA抑制率高达77.60%)，抗坏血酸、柠檬酸的抑制效果次之，亚硫酸氢钠的抑制效果较差。

对清徐黑鸡心葡萄多酚氧化酶活性的抑制作用：抗坏血酸gt;EDTAgt;柠檬酸，通过正交实验得出的复合抑制剂优化组合：A1B2C2，即柠檬酸0.04 mmol·L-1，EDTA0.08 mmol·L-1，抗坏血酸0.08 mmol·L-1，抑制率达到85.67%。

[1]王宏延,曾凯芳,贾凝,等.不同质量浓度臭氧化水对鲜切西兰花贮藏品质的影响[J].食品科学,2012,33(2):267-270．

[2]徐芹,乔勇进,方强，等.砀山酥梨多酚氧化酶酶学特性及抑制效应的研究[J].食品科学,2008,29(4):74-77．

[3]Rapeanu G, Van Loey A, Smout C, et al. Biochemical characterization and process stability of polyphenoloxidase extracted from Victoria grape (Vitis vinifera ssp Sativa) [J]. Food Chemistry, 2006, 94(2): 53-61.

[4]李佩艳,侯玉泽,李松彪，等.澳洲青苹多酚氧化酶特性的研究[J].河南农业科学,2006 (9):93-96.

[5]鲁吉珂,牛夏南，王晓东，等.植物源多酚氧化酶筛选及其活性抑制探究[J].食品与发酵科技,2013,49(2):30-33.

[6]熊何健，卢玉兰. 荔枝壳中多酚氧化酶活性研究[J].食品科学, 2006,27(12):183-185.

[7]张莉, 陈乃富. 多酚氧化酶的酶学性质及其应用研究[J].安徽农业学报,2006,12(12): 29-30.

[8]赵丽华.不同抑制剂对石榴多酚氧化酶的影响[J].贵州农业科学,2013,41(2):58-60.

[9]任顺成,张丹,乔青青.小麦中多酚氧化酶抑制剂的筛选及应用[J].河南工业大学学报(自然科学版),2013,34(1):1-6.

[10]史焱,詹先成,吕太平，等.抗氧剂亚硫酸钠、亚硫酸氢钠及焦亚硫酸钠氧化反应速率常数的测定[J].化学学报,2006,64(6):496-500.

[11]庞凌云,祝美云,詹丽娟,等.菜花多酚氧化酶的酶学特性研究[J].河南农业大学学报,2013，47(1):83-87.

[12]罗志刚,杨连生,姜绍通，等.抗坏血酸和亚硫酸钠在甘薯破碎中抗褐变的研究[J].食品工业科技, 2002(5): 52-53.

TheInfluencesofDifferentInhibitorsonPolyphenolOxidaseActivityinBlackHeartGrapes

Guo Yanping, Liu Meilin, He Dongliang, Zhao Jinan

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,TaiyuanInstituteofTechnology,TaiyuanShanxi030008,China)

The effects of inhibitors including sodium hydrogen sulfite, citric acid, EDTA and ascorbic on polyphenol oxidase activity (PPO) in heart-shaped Qinxu black grapes were investigated. Based on the results of single factor experiment, orthogonal experiment was applied to optimize the formula of anti-browning additive for the storage and transportation of black heart-shaped grape . Results indicated that citric acid, EDTA and ascorbic acid showed better inhibition effect on PPO activity, the best combination for inhibition was A1B2C2, namely citric acid tendency for 0.04 mmol·L-1, EDTA 0.08 mmol·L-1tendency, L ascorbic acid tendency for 0.08 mmol·L-1, with PPO activity inhibition rate up to 85.67%.

Black grapes; Polyphenol oxidase; Activity; Inhibitors

2014-05-13

2014-06-18

郭艳萍(1984-)，女(汉)，山西太原人，硕士，研究方向：植物蛋白质工程。

山西省高等学校大学生创新创业训练项目；太原工业学院青年科学基金资助项目(2013LQ01)。

TS201.3

A

1671-8151(2014)05-0477-04

(编辑：马荣博)