Livin与Smac/DIABLO在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

元建华 彭大为 李建旺 王美清

肿瘤的发生、发展与细胞凋亡的紊乱密切相关。凋亡受抑制将导致细胞存活时间延长，有利于转化突变的细胞生长积累，最终导致肿瘤的产生。细胞凋亡受多条通路和多种因子的调控。Livin 蛋白是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)成员之一，在人体的大多数正常组织中不表达或低表达，而在大多数恶性肿瘤中高表达，并使肿瘤细胞对缺血、缺氧、化学治疗及放射治疗等产生耐受[1-2]。第二个线粒体来源的半胱氨酸酶的激活剂(second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low PI，Smac/DIABLO)是1种重要的促凋亡因子，可以与IAPs成员结合，解除IAPs对含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspar-tate specific proteinase，Caspase)的抑制从而促进细胞凋亡[3]，因此Smac/DIABLO蛋白在肿瘤细胞凋亡中有着极其重要的作用。本研究采用免疫组化方法，检测 100例结直肠癌患者中Livin蛋白、Smac/DIABLO蛋白的表达情况，以了解它们在结直肠癌中的表达情况及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2006年1月至2009年12月海口市人民医院收治的100 例初治结直肠癌患者的术后组织标本，所有患者均行根治性手术，术后定期随访。患者均具有完整随访资料，转移复发情况明确。末次随访时间为 2013 年 6 月。其中男性54例，女性46例，男女比例为1.17∶1；年龄23～74岁，中位年龄 54 岁；肿瘤直径<5 cm 49例，≥5 cm 51例。TNM分期采用AJCC第七版分期：Ⅰ+Ⅱ期 48例，Ⅲ期 52例。肿瘤浸润深度：T1+T2期12例，T3期88例。组织学分类：高分化25例，中分化64例，低分化11例。所有病例术前未接受过任何抗癌治疗。30 例正常对照标本取自经病理检查证实无肿瘤残留的结直肠癌手术切除标本的切缘。

1.2 免疫组化SP法

取上述 130 例石蜡包埋标本，常规制备 4 μm厚切片，常规二甲苯脱蜡，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶及微波抗原修复后，滴加一抗及二抗，DAB染色，苏木精复染。一抗为兔抗人Livin多克隆抗体(稀释浓度为1∶100)、兔抗人Smac/DIABLO多克隆抗体(稀释浓度为1∶200)，均购自美国ProSci生物技术公司。采用PBS代替一抗作为阴性对照；采用美国ProSci生物技术公司提供的阳性病理切片作为阳性对照。

1.3 结果判断标准

采用光学显微镜观察切片中 10 个具有代表性视野中阳性细胞的比例，参考文献[4]并结合实际情况制定阳性标准。无阳性细胞为 0 分，阳性细胞率1%～25%为 1 分，26%～50%为 2 分，51%～ 75%为 3 分，≥76%为 4 分；染色阴性为 0 分，弱染色为 1 分，中等强度染色为 2 分，强染色为 3 分。 将两者分数相加为最终结果。将其分为 4个等级：0～1分为阴性(-)，2～ 3 分为弱阳性(+)，4～ 5 分为中等阳性(++)，6～ 7 分为强阳性(+++)。

1.4 统计学分析

应用 SPSS 13.0 统计软件对数据进行分析。不同组间蛋白表达差异采用χ2检验，采用Spearman法分析 Livin 蛋白及Smac/DIABLO 蛋白表达的相关性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin 蛋白与 Smac/DIABLO 蛋白在结直肠癌与癌旁正常组织中表达情况

结直肠癌组织中Livin 蛋白阳性表达率为64.0%(64/100)，而癌旁正常组织仅为16.7%(5/30)，结直癌组织明显高于癌旁正常组织(χ2=11.208，P<0.001)。Smac/DIABLO 蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率为60.0%(60/100)，癌旁正常组织其阳性表达率为80.0%(24/30)，两者比较，χ2= 4.832，P<0.05。

2.2 Livin 及 Smac/DIABLO蛋白表达与结直肠癌组织临床病理特征的关系

Livin 蛋白阳性表达率与结直肠癌临床分期、肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小及组织分化程度无关(P>0.05)。Smac/DIABLO蛋白阳性表达率与结直肠癌临床分期、肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小及组织分化程度无关(P>0.05)。见表 1。

表1 结直肠癌组织中Livin及Smac/DIABLO蛋白表达与其临床病理特征的关系/例

2.3 Livin 与 Smac/DIABLO 蛋白表达的相关性分析

36例Livin蛋白表达阴性的标本中有22例Smac/DIABLO蛋白表达阳性(61.1%)，60 例Smac/DIABLO蛋白表达阳性的标本中19例Livin蛋白表达阴性(31.7%)，经Spearman相关性分析，结直肠癌组织中Livin蛋白与Smac/DIABLO蛋白表达呈显著负相关(γ=-0.348，P<0.05)。

3 讨论

肿瘤的无限制的增殖及凋亡紊乱是肿瘤发生发展的重要原因，凋亡抑制蛋白的增多或凋亡促进蛋白的减少，均可导致肿瘤细胞凋亡减少而影响肿瘤的发展。Livin蛋白是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)最新的成员之一，是2000年由Kasof等[5-7]4个独立的研究小组分别应用不同的方法从不同的组织中获得的，分别命名为Livin、黑色素瘤凋亡蛋白抑制因子(melanoma inhibitor of apoptosis protein，ML-IAP)、肾IAP(kidney inhibitor of apoptosis protein，KIAP)，后统称为Livin蛋白。Livin蛋白主要通过N端BIR结构区与Caspases结合启动以阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径，从而抑制凋亡蛋白酶的活性。Livin 蛋白可与激活形式的Caspases-3和Caspases-7结合，并抑制其活性，此外还可与未加工的或断裂形式的Caspases-9结合，抑制由Apaf-1、细胞色素C及dATP诱导的Caspases-9激活作用。Livin蛋白在人体的大多数正常组织中不表达或低表达，而在大多数恶性肿瘤中高表达。本研究显示 Livin蛋白在结直肠癌中阳性表达率为64.0%(64/100)，而在癌旁正常组织中仅为16.7%(5/30)，差异具有统计学意义，提示 Livin蛋白在结直肠癌的发生及发展过程中的重要作用。Livin蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达与患者的年龄、性别及肿瘤的大小无关，但与临床分期、肿瘤浸润深度、组织分化程度及淋巴结转移有关。Livin蛋白在Ⅰ-Ⅱ期阳性表达率为52.1%(25/48)，在Ⅲ期阳性表达率为75.0%(39/52)，两者差异有统计学意义(P<0.022)；肿瘤浸润深度T1+T2阳性率为33.3%(4/12)，T3+T4阳性率为68.2%(60/88)，两者差异有统计学意义(P<0.012)；淋巴结转移阳性表达率为75.0%(39/52)，无淋巴结转移组阳性表达率为52.1%(25/48)，两者差异有统计学意义(P<0.022)，表明 Livin蛋白的高表达与淋巴结转移、肿瘤浸润深度以及临床分期相关。Livin蛋白检测可以用来判断结直肠癌患者的预后，高表达提示预后较差，高表达是细胞凋亡的表现，低表达或不表达提示预后较好。

Smac/DIABLO蛋白是2000 年7月首次报道的1种促调亡蛋白，主要定位于线粒体[8]，通过与凋亡执行蛋白Caspase 3竞争性的结合IAPs[9]如Survivin，解除IAPs对Caspase 3的抑制作用，从而促进细胞凋亡，Smac/DIABLO蛋白还可以激活机体对肿瘤细胞的免疫反应促进肿瘤细胞死亡[10]。有文献报道，Smac/DIABLO蛋白在癌组织中的表达与结直肠癌的肿瘤临床分期、淋巴结转移、远处转移和病理分化程度有关，Smac/DIABLO蛋白表达阴性的结直肠癌患者较表达阳性的患者预后更差[11-13]。本研究显示Smac/DIABLO蛋白在结直肠癌中阳性表达率为60.0%(60/100)低于癌旁正常组织的80.0%(24/30)，差异具有统计学意义。Smac/DIABLO蛋白在结直肠肠癌组织中的阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及组织分化程度无关，但与临床分期、肿瘤浸润深度、组织分化程度及淋巴结转移有关。Smac/DIABLO蛋白在Ⅰ-Ⅱ期阳性表达率为75.0%(36/48)，在III期阳性表达率为46.2%(24/52)，两者差异有统计学意义，P<0.004；肿瘤浸润深度T1+T2阳性率为25.0%(3/12)，T3+T4阳性率为64.8%(57/88)，两者差异有统计学意义(P<0.008)，淋巴结转移阳性表达率为46.2%(24/52)，无淋巴结转移组阳性表达率为75.0%(36/48)，两者差异有统计学意义，P<0.022；说明大肠癌中 Smac/DIABLO 蛋白表达缺失与结直肠癌肿瘤浸润深度、淋巴结转移和临床分期相关。本研究提示Smac/DIABLO蛋白低表达与结直肠癌进展密切相关，而低表达是细胞凋亡抑制的表现，但抑制 Smac/DIABLO蛋白释放的原因目前还不清楚，值得进一步探讨。

Livin蛋白的抗凋亡作用还受到线粒体释放的Caspase活化蛋白(Smac/DIABLO)的调节，Livin蛋白能通过BIR结构与Smac/DIABLO蛋白结合，促使Smac/DIABLO蛋白经泛素2蛋白酶途径降解，降低Smac/DIABLO 蛋白表达水平，抑制细胞凋亡[14]。本研究结果显示，在结直肠癌中Livin蛋白 与 Smac/DIABLO蛋白表达呈负相关，提示两者的基因表达在结直肠癌中存在负反馈调节或存在相互拮抗的关系，Smac/DIABLO蛋白表达减少直接或间接引起 Livin 蛋白的表达升高，或者是由于Livin 蛋白或其他 IAP 家族成员的过表达抑制了Smac/DIABLO蛋白从线粒体的释放，从而减少了细胞的凋亡。 Smac/DIABLO蛋白的低表达及 Livin 蛋白的高表达在结直肠癌的发生发展中起了重要作用，两者可能在结直肠癌细胞凋亡信号传导网络中起到重要作用，但其具体作用机制尚未阐明，联合检测Livin 蛋白和 Smac/DIABLO蛋白在结直肠癌中的表达情况，有助于评价结直肠癌的预后情况，并为结直肠癌的抗肿瘤治疗提供了新的途径和方法。

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