PTP1B在胃癌组织中表达及其对胃癌细胞系MKN28增殖、侵袭行为的影响

叶亚峻，朱小存，朱治淮，刘琪，秦凯

（淮安市肿瘤医院普通外科，江苏223200）

PTP1B在胃癌组织中表达及其对胃癌细胞系MKN28增殖、侵袭行为的影响

叶亚峻*，朱小存，朱治淮，刘琪，秦凯

（淮安市肿瘤医院普通外科，江苏223200）

目的：研究蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞株MKN28增殖、侵袭的影响，为PTP1B作为靶点治疗胃癌提供理论基础。方法：采用Western blot检测PTP1B在39例胃癌组织及8例非癌胃组织中的表达情况，分析其与胃癌重要病理因素之间的关系，并通过构建靶向PTP1B的ShRNA的真核表达质粒Sh-PTP1B转染人胃癌细胞系MKN28，应用Western blot检测PTP1B蛋白表达，采用CCK-8、Transwell侵袭小室检测MKN28细胞增殖和侵袭。结果：PTP1B在胃癌组织的表达明显高于非癌胃组织，PTP1B表达与胃癌患者组织分化程度及TNM分期明显相关；胃癌细胞系MKN28中转染Sh-PTP1B后，细胞PTP1B蛋白表达明显减少，细胞增殖和侵袭明显抑制（P＜0.05）。结论：PTP1B在胃癌的生长和侵袭过程中发挥重要作用，有可能成为靶向治疗胃癌的潜在靶点。

胃癌；RNA干扰；蛋白质酪氨酸磷酸酶1B

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，已成为世界上癌症死亡的第二大原因[1]。然而，引起胃癌发生发展的分子机制尚未完全明确。

蛋白质酪氨酸磷酸化的改变在控制细胞增殖、侵袭及肿瘤转移等细胞生物学行为方面发挥着重要的作用[2]，其程度受蛋白质酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的调控。蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphate 1B，PTP1B）是蛋白质酪氨酸磷酸酶家族中的一员[3]，已被证实与多种肿瘤的发生相关[4-7]。PTP1B在胃癌患者中高表达，且与肿瘤的转移及分级有密切的关系[8]。

本研究首先检测PTP1B在胃癌组织中的表达情况，然后构建靶向PTP1B的小发夹干扰序列，转染胃癌细胞MKN28，检测沉默PTP1B基因后对胃癌细胞增殖和侵袭的影响，为PTP1B作为基因靶点治疗胃癌提供进一步的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本及细胞株：收集淮安市肿瘤医院2008年5月～2013年5月，经手术切除的胃癌组织标本39例和胃癌手术标本边缘的非癌组织8例，均未进行过术前放化疗。39例胃癌标本中男25例，女14例，年龄45～77岁，中位年龄57岁。据国际抗癌联盟（UICC）和美国癌肿联合会（AJCC）2002年TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期20例。其中高分化18例，低分化19例，未分化癌2例。上述组织标本均术后半小时内置入-80℃冰箱冻存备用。所取标本均经患者或患者家属同意，所有实验过程及内容均经淮安市肿瘤医院伦理委员会批准同意。胃癌细胞株MKN28购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 试剂：合成构建基于PTP1B小RNA的干扰质粒及空载体（上海吉玛生物制药有限公司）。RMPI-1640培养基，FBS胎牛血清，青链霉素（美国Gibco公司），细胞转染LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），兔抗人PTP1B单克隆抗体（美国Abcam公司），鼠抗人β-actin（上海碧云天生物科技公司），组织细胞裂解液及Western blot试剂盒、细胞增殖实验CCK-8试剂盒（南通碧云天生物技术研究所）。细胞侵袭Transwell小室及Matrigal goal基质胶（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染：37℃，5%CO2条件下使用含1%青链霉素及10%FBS的RMPI-1640培养胃癌MKN28细胞株。细胞达到80%融合度时传代及进行相关操作。转染前1天将处于对数生长期的胃癌细胞约5×105个细胞/孔接种于六孔板，加入适量含10%FBS的培养基，5%CO2培养箱进行培养，培养1天后待融合度达到80%时进行转染。转染时加入4μg质粒加10μL转染试剂。同时对空载体进行转染作为阴性对照。加入无血清培养基进行培养，6h后更换含10%FBS进行培养。

1.2.2 Western blot：-80℃冰箱中取出冻存组织标本，碾磨成絮状，并加入适量Western裂解液及PMSF提取组织总蛋白；收集细胞，PBS清洗细胞，采用Western裂解液及PMSF直接提取总蛋白。以SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，转膜，5%脱脂奶的TBST室温封闭3 h，以1∶1 000稀释兔抗人PTP1B及1∶1 000稀释鼠抗β-actin抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜(3次，每次10min)后以1∶1 000稀释的酶标二抗(辣根酶标记的羊抗兔和驴抗鼠IgG)室温孵育2 h，保鲜膜封膜，化学发光法(ECL)显影。使用Odyssey Imager采集图像并做光密度分析，测定数据以光密度(optical density,OD)表示，OD值越大，蛋白条带密度越高。为排除蛋白上样量不准确等条件干扰，以测得蛋白OD值/Actin蛋白OD值的比值表示蛋白条带相对密度。

1.2.3 细胞增殖实验：将对数生长期细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，设3个复孔，加入适量含10%FBS的培养基，5%CO2培养箱进行培养。分别于转染后24h，48h，72h，96h每孔加入10μL CCK-8溶液，培养箱中继续培养约2h，酶标仪于450nm处测定每孔吸光值，比较各组细胞增殖情况。

1.2.4 Transwell细胞侵袭实验：将Matrigal goal基质胶放入4℃冰箱过夜待其溶解为液态，Transwell小室上层铺Matrigal goal，放入培养箱中不少于1h，待基底膜干燥后，将对数生长期细胞调匀后滴入小室上层，各个小室中滴入的细胞数相等，约为1×103，放入培养箱，培养24h。托马斯亮蓝对小室下层底面进行染色，显微镜观察小室下层细胞穿透情况，拍照，并随机取5个视野，计算并比较。

1.3 统计学处理采用SPSS19.0统计软件，计量资料以s表示，多组间差异性比较进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTP1B在胃癌及非癌胃组织中的表达及其与胃癌常见病理因素之间的关系Western Blot检测39例胃癌组织和8例非癌胃组织中PTP1B表达情况，结果如图1所示，PTP1B的表达在胃癌组织中（1.042±0.057）明显高于非癌胃组织（0.367±0.031），差异有统计学意义(P＜0.05)。同时，我们将按照不同病理因素将胃癌患者分为不同的组别，并计算不同组别患者PTP1B的表达均数。结果显示PTP1B的表达与组织分化程度和TNM分期有明显的相关性（P＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小无相关性（P＞0.05）（表1）。

图1 Western blot检测PTP1B在胃癌组织和非癌正常组织中的表达情况

表1 PTP1B蛋白的表达与各种临床因素的相关性分析

2.2 转染后PTP1B蛋白的表达干扰PTP1B质粒转染胃癌MKN28细胞后，Western blot结果显示，PTP1B蛋白表达水平较阴性对照组和未转染组明显下降如图2，以未转染对照组为参照转染效率为62.25%。

图2 Western Blot检测转染后PTP1B蛋白的表达变化

2.3 干扰PTP1B表达后对人胃癌细胞系MKN28增殖的影响细胞增殖CCK-8法检测干扰PTP1B质粒转染胃癌细胞MKN28后24h、48h、72h、96h各组细胞增殖情况（图3）。阴性对照细胞和未转染细胞相比，各时间段细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05)。干扰PTP1B组胃癌细胞与其它两组比较自细胞转染48h后增殖明显受到抑制，72h及96h增殖抑制效果更加明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图3 CCK-8法检测胃癌MKN28细胞增殖情况

2.4 干扰PTP1B基因后对胃癌细胞MKN28侵袭能力的影响转染质粒组的胃癌细胞穿透Matrigal基底膜的细胞数为（35±12），显著低于阴性对照组（88±10）和未转染组（95±9）的穿膜细胞数（P＜0.05），如图4。

图4 Transwell小室检测转染后细胞侵袭能力的变化（×100）

3 讨论

蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPs)是一类信号转导酶[9]，通过调节细胞内酪氨酸磷酸化水平来调控细胞的生长代谢及迁移、凋亡等。PTP1B具有PTP酶家族的所有保守序列，在乳腺癌、食管癌、卵巢癌，结直肠癌等多种肿瘤细胞生物学行为中发挥着重要的作用[5-7]。Wang等[8]证实PTP1B在胃癌组织中高表达，并与肿瘤的分期相关，然而PTP1B在胃癌组织中发挥何种作用，国内外研究较为少见。本研究首先采用Western blot检测PTP1B在胃癌及非癌胃组织中的表达情况，结果提示PTP1B蛋白在胃癌组织中的表达水平明显高于非癌胃组织，进一步证实了Wang等[8]的结论，也提示PTP1B在胃癌细胞中所发挥的重要作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发展起来的新兴的抑制基因表达的技术，和传统的mRNA水平抑制基因表达的技术相比，具有较明显的优势。运用RNA干扰技术抑制相关基因表达，起到抑制肿瘤细胞增殖侵袭，促进细胞凋亡的作用，从而达到治疗目的[9-11]。本研究检测到PTP1B在胃癌组织中表达明显高于非胃癌组织，且PTP1B的表达与胃癌患者组织分化程度及TNM分期密切相关。然后构建了针对PTP1B的干扰质粒，转染胃癌细胞MKN28，检测PTP1B下调后对胃癌细胞生物学行为的影响。实验证实PTP1B干扰质粒转染胃癌细胞MKN28后，PTP1B蛋白的表达水平明显下调，且显著抑制了肿瘤细胞的增殖效应能力，与Wang等[12]的报道一致。同时本研究结果进一步揭示，利用质粒靶向抑制PTP1B表达后对人工基底膜的侵袭、穿透力明显下降，说明下调PTP1B的表达能显著抑制胃癌细胞的体外侵袭能力。

综上所述，通过构建靶向PTP1B的ShRNA真核表达载体转染细胞后可以高度特异性抑制胃癌细胞中PTP1B的表达，并且抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。PTP1B有望成为胃癌基因治疗的潜在靶点，具体的机制有待于进一步研究。

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Expression of PTP1B in gastric cancer and its effect on proliferation and invasion of gastric cancer cell line MKN28

YE Yajun,ZHU Xiaocun,ZHU Zhihuai,LIU Qi,QIN Kai
（Department of general surgery,Huaian Cancer Hospital,Jiangsu 223200）

Objective:To study the expression of Protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B)in gastric carcinoma and its effect on proliferation and invasion of gastric cancer cell line MKN28.Methods:The expression of PTP1B was detected by Western blot in 39 cases of gastric cancer and 8 cases of non-cancerous gastric tissues,and its relation with the important factors for gastric pathology was analyzed.Through building the ShRNA targeting PTP1B eukaryotic expression plasmid Sh-PTP1B to transfect human gastric cancer cell line MKN28,the expression of PTP1B was detected by Western blot and the proliferation and invasion were detected by CCK-8 and Transwell invasion chamber assay.Results:PTP1B expression in gastric cancer tissues was significantly higher than in non-cancerous gastric tissue,and was significantly correlated with tissue differentiation and TNM staging.The expression of PTP1B was effectively reduced after the transfection.And the RNA interference led to the restraining of tumor cells proliferation and invasion（P＜0.05）.Conclusion:PTP1B plays an important role in the growth and invasion of gastric cancer,and it may be a potential target for targeted therapy of gastric cancer.

gastric cancer;RNA interference;Protein tyrosine phosphatase 1B

R735.2

A

2013-10-09

1006-2440（2014）02-0111-04

叶亚峻，男，汉族，江苏淮安人，生于1977年1月，本科，主治医师。研究方向：消化道肿瘤。E-mail：hayeyajun1l@163.com