丹红注射液促进兔重建前交叉韧带早期腱-骨愈合实验研究

蔡明，周振宇，曹毅，刘培超，刘宇博

（南通大学附属医院骨科，江苏226001）

丹红注射液促进兔重建前交叉韧带早期腱-骨愈合实验研究

蔡明*，周振宇，曹毅，刘培超，刘宇博

（南通大学附属医院骨科，江苏226001）

目的：通过建立兔前交叉韧带重建模型，分别对实验标本进行组织学及生物力学研究，为临床上丹红注射液是否能影响腱-骨愈合提供参考。方法：成年新西兰兔20只，膝关节40个，随机分为丹红注射液组（观察组）及空白对照组，每组10只。所有动物均行自体跟腱移植重建双侧前交叉韧带。观察组腱-骨界面注射丹红注射液,对照组注射生理盐水。在术后第4周、8周时处死观察组和对照组各5只兔子。每个时间段处死的兔子中，观察组5只兔子共10个膝关节中，取5个作组织学观察，剩余的5个作抗拉力生物力学测试。结果：组织学观察发现：术后4周观察组可见成纤维细胞明显增生，以及少量排列有序的胶原纤维，同时腱骨界面可见少量的新血管生成，成软骨细胞增生，肌腱和骨隧道间间隙减小。对照组骨隧道和肌腱间有新生肉芽组织和少量成纤维细胞增生，腱骨界面可见少量的胶原纤维，但排列疏松且不规则。术后8周观察组骨隧道和移植肌腱间可见较多且排列整齐胶原纤维，腱骨界面更成熟，并可见类似垂直胶原纤维。对照组腱骨界面可见大量成纤维细胞，胶原纤维较多排列仍不规则，腱骨界面可见少量骨组织生成,两组界面形态学分布差异有统计学意义（P＜0.05）。术后4周观察组腱骨界面的抗拉脱强度高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：前交叉韧带重建术后应用丹红注射液处理，腱骨界面成熟成纤维细胞及Sharpey样纤维更早出现，观察组肌腱移植物的生物力学特性优于对照组，丹红注射液能促进肌腱移植物在骨隧道中的早期愈合。

膝关节前交叉韧带损伤；前交叉韧带重建术；丹红注射液；腱骨愈合

膝关节前交叉韧带损伤后自复性较差，长期造成膝关节的不稳，最终膝关节软骨面及半月板遭受磨损[1]。腱-骨愈合是骨隧道与移植物之间的愈合方式，腱-骨愈合越牢固其稳定性越高。实验证明骨膜、细胞生长因子、骨形态发生蛋白等生物材料均能有效的加快腱-骨愈合[2-3]。但这些物质在临床上利用率较低，腱骨愈合和骨折愈合的过程有相似之处。实验证明某些活血化瘀的中药能缩短骨折愈合的时间[4-5]，推测其可促进腱骨愈合。丹红注射液为临床上使用较为频繁的活血化瘀药物，本研究探索丹红注射液对腱骨愈合的影响。

1 材料和方法

1.1 材料健康成年新西兰兔20只，体重2.5～3.0kg，雌雄不限(南京市江宁区靑龙山动物繁殖场繁殖，合格编号：0022162，南通大学实验动物中心提供)。随机分为2组，丹红注射液组（观察组）和生理盐水注射液组（对照组），各组10只新西兰兔（20个膝关节）。前交叉韧带重建术（anterior cruciate ligament reconstruction，ACLR）后分别在股骨端及胫骨端的腱骨界面注射等量的丹红注射液和生理盐水注射液各0.5mL。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立：用30mg/kg巴比妥经兔耳缘静脉行麻醉成功后，将兔子四肢固定仰卧于操作台上。分别做双侧下肢后内侧切口，显露跟腱后，切取并修成长约2cm，直径约3.0mm的移植跟腱。两端分别用4号非吸收性外科缝线锁边缝合，然后湿生理盐水纱布包裹备用。分别取双侧膝关节髌韧带内侧缘长约5cm纵弧形切口，切开关节腔。然后向外侧脱位髌骨，极度屈膝切除髌下脂肪垫及周围组织，并注意保护外侧副韧带，清晰暴露膝关节前交叉韧带并切断，查前抽屉试验阳性。选取克氏针（3.0mm），在前交叉韧带“足印区”钻取胫骨和股骨隧道，将编织好的肌腱拉入骨隧道中。分别在股骨骨隧道口上方及胫骨骨隧道口下方冠状位穿孔，将肌腱牵引线穿出并打结固定。观察组动物胫骨及股骨隧道内均注射丹红注射液各0.5mL，空白对照组注射等量的0.9%NaCl注射液。闭合切口，75%乙醇消毒及无菌纱布包扎。

1.2.2 术后处理：术后给予青霉素40万单位/天肌注，持续3天。由南通大学动物实验中心笼养，后肢不固定,自由活动。分别在术后第4、8周随机在2组中各处死新西兰兔5只，每组5只兔子共10个膝关节，取材并完整保留股骨及胫骨端骨段全长隧道。10%中性甲醛溶液固定、10%EDTA脱钙、浸蜡、包埋，沿着腱骨界面纵轴面切片（厚约5μm），常规HE染色观察，剩余5个膝关节留作抗拉力测试。

1.2.3 形态学观察及生物力学测试：（1）大体观察：肉眼观察重建前交叉韧带有无坏死、变形、松动、滑膜覆盖剂隧道口封闭情况。关节腔内是否有积液、粘连。（2）组织学观察：参照Yamakado方法将界面分为4类：腱骨分离、疏松结缔组织连接、sharpey纤维连接及直接连接。高倍镜下观察成纤维细胞的形态、新生血管及骨形成等。（3）生物力学测试：将股骨和胫骨残端分别固定于INSTRON-4411型拉力试验机上。以2mm/min的速率加载，直至韧带从骨隧道中抽出，记录此时的最大拉力负荷。

1.3 统计学处理采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，计量资料采用s表示，组间差异性比较采用配对t检验，计数资料组间差异性比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本大体观察术后20只实验动物伤口及全身情况良好。各时间段动物膝关节半月板及关节软骨无磨损，未见脓性分泌物及其他不良情况，移植肌腱连续性完整。腱骨界面间可见到一定的愈合倾向。

2.2 标本组织学观察对照组（图1）：腱骨界面间为疏松结缔组织，大量成纤维细胞，核大呈圆形，细胞混乱无固定排列，有的尚可见到移植肌腱和骨隧道间还有分离，少量新生血管。术后4周观察组（图2）：腱骨界面可见到丰富的成纤维细胞，核大呈梭形，其中有一定量的新生血管。对照组（图3）：腱骨界面结合仍较疏松，连接主要为胶原纤维，可见少量软骨细胞；腱骨界面间新生血管少。术后8周观察组（图4）：腱骨界面间结合较紧密，可见排列有序类似于sharpey纤维，还可见到一定量的软骨细胞，并有明显的软骨陷窝；两组均未出现典型直接连接形态。术后4周观察组和对照组腱骨愈合分型比较，差异无统计学意义（χ2=3，P＞0.05）。术后8周两组腱骨愈合分型比较差异有统计学意义（χ2=10.044，P＜0.05）。观察组腱骨界面愈合更好（表1）。

图1 术后4周对照组腱骨界面尚有分离，可见疏松结缔组织，成纤维细胞核呈圆形。（HE染色，100×）

图2 术后4周观察组腱骨界面为结缔组织，成纤维细胞核呈梭形。（HE染色，100×）

图3 术后8周对照组腱骨界面为结缔组织，细胞核呈梭形的成纤维细胞,可见少量软骨细胞。（HE染色，100×）

图4 术后8周观察组腱骨界面为致密结缔组织，成纤维，细胞核呈梭形，可见类似sharpey纤维及软骨细胞并有明显的软骨陷窝。（HE染色，100×）

表1 各组白兔不同时期的Yamakado界面形态学分型（n=10）

2.3 生物力学检测术后第4周观察组平均最大拉脱负荷为48.65±4.19 N，对照组平均最大拉脱负荷为29.01±5.55 N。术后8周仅测得对照组2例平均最大拉脱负荷为79.46N,观察组1例平均最大拉脱负荷为101.84N,因大部分为移植肌腱非隧道内拉脱而是实质部分断裂，故只对4周组的生物力学数据进行统计学处理，结果所有在同一时间段，观察组的抗牵拉力强度大于对照组，两组拉力负荷比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

近年来随着人们对膝关节生物力学与前交叉韧带功能认识的深入，对前交叉韧带重建的观念发生了很大的变化。美国每年需要重建膝关节前交叉韧带的患者超过100，000例[6]，但术后需进行翻修的患者高达3000～10，000例[7]。其根本原因主要包括术后反复创伤、隧道定位不准确、内固定不牢固及腱骨的延迟愈合等[8]。大量动物实验表明，获得稳定可靠的腱-骨愈合往往需要12～24个月甚至更长的时间[9-10]。因此如何缩短腱骨愈合的时间就成为影响前交叉韧带重建效果的最关键性因素。

腱骨愈合被定义为在移植肌腱和骨之间结构一体和功能连续的形式[11]。腱骨愈合过程需要经历移植物的变性、血管再生、细胞再生等过程。正常的前交叉韧带的止点具有典型的结构，包括韧带、纤维软骨、钙化软骨和骨[12]。研究表明前交叉韧带重建术后腱-骨愈合有2种方式，一种是直接愈合（纤维软骨止点），类似于正常的纤维软骨连接[13]。另一种是间接愈合（纤维止点），其特征性结构是Sharpey纤维。一般来说Sharpey纤维是指一些穿插性的胶原纤维将肌腱与骨隧道相连接，这种纤维通常与骨髓道的轴向垂直[14]。

促进腱骨愈合的方法很多，包括骨膜、细胞生长因子、骨形态发生蛋白等，新生血管的形成是腱骨界面组织修复时改善组织血流的基础。胡安义等[15]在动物模型上指出，丹红注射液具有活血化瘀及保护血管内皮的作用。马金霞等[16]研究表明，丹红注射液可增加血清VEGF的含量，并且能促进新生血管的形成。良好的血供是加快腱骨愈合最基本的有利环境，腱骨愈合中另一个重要的环节是腱骨界面的骨形成。王梦华等[5]在治疗骨折时应用丹红注射液疗效表明，丹红能促进血清骨源性碱性磷酸酶(ALP)的增高，反映丹红注射液能促进成骨活跃，进而促进骨折愈合及成骨作用。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可促进一氧化氮（NO）的产生，而高浓度的一氧化氮能抑制成骨细胞的增殖，还可抑制成骨细胞的ALP活性和抑制成骨细胞合成骨钙素等。TNF-α能刺激白介素-6（IL-6）等因子的生成，诱使破骨细胞形成，抑制ALP生成，减少细胞内含钙量，抑制骨的形成。王华等[17]指出丹红能降低血清中IL-6，超敏C-反应蛋白和TNF-α的含量,使组织坏死范围缩小，胶原紊乱和粘液样变性降低。有效抑制骨的吸收作用。本实验尚未对破骨细胞的活性进行详细的测定。

生物力学测试，因8周以后大部分为韧带实质部断裂而非隧道内拉脱，故只记录4周组的生物力学数据。数据显示丹红组相比较对照组有更高的抗拉脱强度，提示丹红组腱骨愈合强度高于对照组，也说明了丹红具有促进腱骨愈合的作用。通过上述组织学与生物力学的研究提示，丹红注射液对移植肌腱在骨隧道内的早期愈合有明显的促进作用。由于本实验各组观察的样本量较少，观察时间较短，术后丹红的长期持续作用仍需进一步观察。此外，丹红注射液促进腱骨愈合的具体机制、从动物研究到临床广泛应用，以及长期的疗效评价仍需做深入的研究。

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The effects on tendon-bone healing by use of Dan-Hong injection in rabbit ACL reconstruction model

CAI Ming，ZHOU Zhenyu，CAO Yi，LIU Peichao，LIU Yubo
（Department of Orthopedics，Affiliated Hospital of Nantong University，Jiangsu 226001）

Objective：To observe whether Dan-Hong injection can affect clinical tendon-bone healing,the rabbit anterior cruciate ligament reconstruction model was built and the animal experiments about histology and biomechanics were investigated.Methods:ACL reconstruction was performed on twenty healthy mature New Zealand White rabbits，with a total of 40 knees.They were randomly divided into the blank control group and the Dan-Hong injection group with 10 animals in each group.Every animal underwent the anterior cruciate ligament reconstruction operation with its Achilles tendon on both knees.Dan-Hong injection was injected into the gap of tendon-bone in the experimental groups.Nothing was used in the gap of tendon-bone in the control groups.After 4 weeks and 8 weeks of the operation,five rabbits in the experimental group and five rabbits in the control group were executed.In each period of time,five knees of the five experimental rabbits executed were taken for histological observation,and the remaining five knees were taken for biomechanical test.Results:20 rabbits survived very well,and there were no infection in the incisions.From histological observation it was found out that in 4 weeks after the operation,there was obviously visible fibroblast cells hyperplasia in the experimental group,a small number of collagen fibers were arranged orderly,there was a small amount of new angiogenesis on the tendon bone interface and there was cartilage cell proliferation.In the controls newborn granulation tissue was found between the tendon and the bone tunnel and a small amount of fibroblasts hyperplasia was observed，and there was a small amount of loose and irregular collagen fibers on the Tendon bone interface.The gap between the tendon and the bone tunnel was smaller.In 8 weeks,in the experimental group,between the transplanted tendon and the bone tunnel,there were more visible and neat rows of collagen fibers.The interface tissue was more mature and contained some analogous perpendicular collagen bundles(Sharpey fibers).In the control group tendon bone interface was visible,largenumbers of fibroblasts were seen,more collagen fibers were observed in irregular arrangement,and a small amount of bone tissue formation was found.The classification on the Yamakado type was significantly different between the two groups(P＜0.05).Biomechanical examination showed that in 4 weeks the pull-out strength was stronger in the experimental group than in the control group,and there was statistical significant difference in the results(P＜0.05).Conclusion:The application of Dan-Hong injection at the tendon-bone interface during ACL reconstruction resulted in the development of an intervening zone of fibro-cartilage and mature fibroblasts.The use of Dan-Hong injection was a novel method offering the potential of more physiologically earlier healing and should be conducted to improve the biomechanical strength.The present study lacks quantitative analysis of criteria,and the mechanics of the promotion of tendon-bone healing has not been absolutely clear.

Anterior cruciate ligament injury of knee joint；Anterior cruciate ligament reconstruction；Dan-Hong injection；Tendon-bone-healing

R686.5

A

p

2013-12-24

1006-2440（2014）02-0107-04