TRPC6在哮喘小鼠肺组织中的表达及其与气道炎症的相关性分析

李建华 周丽芬 刘筱蔼 陈志勇 赵珅婷 彭妙茹 扶招弟

(广州医科大学生理学教研室，广东 广州 510182)

有证据表明哮喘发病率逐年增加〔1〕。哮喘的发病机制相当复杂，目前国际医学界普遍认为哮喘是由多种细胞、细胞因子和炎症介质引起的以气道高反应性为特征的慢性炎症性疾病。经典瞬时受体电位(TRPC)是一种可以介导胞外Ca2+内流的通道，包括TRPC 1～7共7个成员。TRPC6是胞内钙信号产生的一个重要途径〔2〕，因被发现在肺部多种细胞中高表达而成为治疗哮喘和慢性阻塞性肺病的潜在的新药物靶点〔3〕。本研究拟通过建立小鼠哮喘模型，研究哮喘小鼠肺组织中TRPC6与核转录因子(NF)-κB、细胞黏附因子(ICAM)-1的表达及定位，及其与哮喘气道炎症的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物和试剂 Balb/c雌性健康小鼠14只(购自广东省医学实验动物中心)，6～8周龄，体重15～17 g。卵白蛋白(OVA，Sigma公司)；一抗分别为兔抗小鼠TRPC6多克隆抗体(Abcam 公司)、兔抗小鼠NF-κB P65抗体(Abcam公司)、兔抗小鼠ICAM-1抗体(Santa Cruz公司)，二抗辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG(北京鼎国，进口分装)，浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠哮喘模型的建立 实验分为正常组和哮喘组，每组7只。将小鼠放入大小鼠隔离器中饲养，适应环境1 w。致敏期：适应环境后的第1天和第12天，哮喘组小鼠每只腹腔注射0.2 ml的OVA致敏液，正常组注射等体积的生理盐水。激发急性期：于第18～23天给予哮喘组小鼠雾化吸入5%的OVA溶液，1次/d，30 min/次，正常组给予等量生理盐水雾化。慢性期：第26～55天以5%的OVA溶液雾化激发哮喘组小鼠，3次/w，30 min/次，正常组小鼠等量生理盐水雾化。末次雾化激发48 h后，使用美国BUXCO无创小动物肺功能仪检测Balb/c小鼠的气道反应性。

1.2.2支气管肺泡灌洗液(BALF)的细胞计数 测定气道反应性后，每只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠0.1 ml/10 g，使其麻醉。仰卧位固定小鼠，进行气管插管，解剖分离出左肺后结扎左支气管，每次以0.4 ml 磷酸盐缓冲液(PBS)灌洗右肺，反复灌洗回收3次。收集的BALF，于4 ℃ 1 500 r/min离心10 min。沉淀细胞用1 ml PBS重悬，吹打均匀后取10 μl于血细胞计数板上进行白细胞(WBC)总数计数。余下的BALF 4 ℃ 1 500 r/min离心10 min，弃上清，取细胞沉淀作涂片，4%多聚甲醛固定后HE染色，光学显微镜下进行细胞学分类计数，求出嗜酸粒细胞占细胞总数百分比(EOS%)。

1.2.3免疫组织化学法观察TRPC6、NF-κB 、ICAM-1蛋白的表达 将灌洗后的右肺分离，置于4%多聚甲醛溶液中固定，脱水后常规石蜡包埋。取石蜡切片，常规脱蜡，脱水，抗原修复10 min，3%H2O2(80%甲醇配制)室温避光孵育10 min；PBS冲洗3 min×3次，山羊血清37℃封闭20 min；滴加稀释一抗：TRPC6(1∶300)、NF-κB(1∶500)、ICAM-1(1∶300)，37℃孵育1 h；PBS冲洗3 min×3次，滴加1∶600稀释的二抗，37℃孵育1 h；PBS冲洗3 min×3次，DAB显色，蒸馏水冲洗，终止显色。苏木精复染，自来水冲洗，中性树脂封片。显微镜下观察，阳性表达部位为组织出现棕黄色颗粒改变。同一光强度下，显微镜(×200)随机选取5个视野拍照保存，应用Image-pro Plus(IPP)6.0图像分析系统检测累积光密度值(IOD)，计算TRPC6、NF-κB 、ICAM-1蛋白相对表达量。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，均数采用成组设计的t检验、相关性分析采用Pearson 直线相关法。

2 结 果

2.1动物激发后的表现 哮喘组小鼠雾化吸入5～10 min开始出现烦躁不安、喷嚏、呼吸急促、口唇紫绀和腹部痉挛伴腹式呼吸；正常组小鼠雾化吸入时活动自如，未出现烦躁不安、竖毛和呼吸急促等阳性反应。BUXCO无创小动物肺功能仪测试后发现，哮喘组小鼠的气道反应性明显高于正常组。由此可见，哮喘动物模型成功建立。

2.2支气管肺泡灌洗液的细胞计数 经4%多聚甲醛固定，HE染色后进行细胞计数，哮喘组小鼠BALF中的WBC总数(×104/ml)和EOS%分别为(118.14±2.33)和(42.57±1.13)，而正常组的WBC总数(×104/ml)和EOS%分别为(25.64±0.62)和(0.86±0.07)。两组相比，哮喘组的WBC总数和EOS%均明显增高(P<0.01)。

2.3TRPC6蛋白在肺组织的表达与定位 免疫组化结果显示，正常小鼠肺组织中支气管上皮细胞有少量阳性表达，其他部位表达不明显，而哮喘小鼠肺组织中支气管上皮细胞、浸润的炎症细胞、血管内皮细胞、肺泡上皮细胞表达均明显增强(P<0.01)(表1，图1)。

2.4NF-κB蛋白在肺组织的表达与定位 NF-κB 亚基P65免疫组化结果显示，正常组支气管上皮细胞仅有少量P65表达，而哮喘组支气管上皮细胞、浸润的炎症细胞、血管内皮细胞、肺泡上皮细胞的表达均较正常组有明显增强(P<0.01)(表1，图2)。

2.5ICAM-1蛋白在肺组织的表达与定位 ICAM-1蛋白免疫组化结果显示，正常小鼠肺组织中支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞表达较弱，哮喘小鼠肺组织中除上述细胞外还有浸润的炎症细胞表达均增强(P<0.01)(表1，图3)。

2.6相关性分析 结果显示，小鼠肺组织中TRPC6蛋白表达与NF-κB、ICAM-1蛋白呈显著性正相关(r分别为0.72和0.62，P<0.05)；TRPC6蛋白表达也与BALF液中的WBC总数、EOS%呈显著性正相关(r分别为0.82和0.84，P<0.01)。

图1 小鼠肺组织TRPC6免疫组化染色图(×200)

图2 小鼠肺组织NF-κB P65免疫组化染色图(×200)

图3 小鼠肺组织ICAM-1免疫组化染色图(×200)

表1 两组小鼠肺组织TRPC6、NF-κB、ICAM-1蛋白表达情况

3 讨 论

ICAM-1在结构上属于免疫球蛋白超家族，其可介导炎症细胞黏附至血管内皮细胞、上皮细胞调节炎症反应，还可介导T细胞与T细胞、T细胞与靶细胞、T细胞与B细胞的相互作用参与免疫应答反应，因此成为许多炎症性疾病(如哮喘)发病机制的研究热点。ICAM-l在静止的白细胞、内皮细胞呈低水平表达，但在干扰素-γ、白介素-1β和肿瘤坏死因子-α等一些因素的刺激下，ICAM-1在上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等上表达增加。这些细胞上调表达ICAM-l可以受到许多环节的调控，目前研究较多的是基因水平转录的调控。NF-κB是一种多功能核转录因子，能促进细胞因子、黏附分子、趋化因子等的转录，在机体的免疫应答、炎症反应和细胞的生长发育等方面发挥重要作用〔4〕。NF-κB 是由P50 和P65组成的异源二聚体，通常情况下，抑制因子IκB同NF-κB二聚体相结合，使其以失活状态存在于胞质中。在外源刺激作用下，发生IκB的泛素化及蛋白酶途径的降解，引起NF-κB-IκB复合物的解体，从而使NF-κB活化并借助核定位信号进入细胞核发挥转录调节的作用。文献报道〔5，6〕，凝血酶诱导的NF-κB亚基P65的活化可调控ICAM-1，其与ICAM-1基因的κB位点结合从而促进ICAM-1的表达。Hart等〔7〕利用EMSA和免疫组化技术首次在轻度哮喘病人的诱导痰和支气管活检标本中发现NF-κB的活化较正常组增加，NF-κB表达的部位主要是气道上皮细胞和炎症细胞。Furusho等〔8〕发现，与野生型小鼠相比较，ICAM-1基因敲除小鼠中的炎症细胞数目、气道高反应性、支气管肺泡灌洗液中的细胞因子等均减轻。以上研究提示，气道炎症可能与NF-κB介导的ICAM-1有关。

NF-κB、ICAM-1的表达具钙依赖性〔9，10〕，Ca2+浓度的升高机制比较复杂，可能与Ca2+内流有关。有文献报道〔11〕TRPC通道是Ca2+内流主要途径。凝血酶能诱导细胞内钙浓度的增加，Bair等〔12，13〕用TRPC通道阻断剂2-APB能抑制凝血酶诱导人肺动脉内皮细胞中的钙浓度增加、NF-κB的活化以及ICAM-1 mRNA的表达，离体培养的TRPC4基因敲除小鼠肺内皮细胞ICAM-1 mRNA较野生型表达下降，Bair等〔12〕的研究提示NF-κB依赖性的ICAM-1与TRPC4有一定的联系，但与TRPC6之间的关系目前未见报道。Finney-Hayward等〔14〕发现正常人肺泡和肺组织巨噬细胞表达TRPC6 mRNA和蛋白，进一步的研究发现慢性阻塞性肺病的病人肺泡巨噬细胞TRPC6 mRNA比正常组显著增高但TRPC3和TRPC7 mRNA的表达却无差异，提示TRPC6可能与肺组织巨噬细胞活化有关；Sel等〔15〕用OVA急性致敏/激发TRPC6基因敲除小鼠，发现支气管肺泡灌洗液中IL-5、IL-13含量降低，气道嗜酸性细胞浸润和血IgE水平明显减少，提示TRPC6可能与哮喘的发病机制有关。本研究提示，TRPC6可能通过NF-κB和ICAM-1使炎症细胞浸润，参与哮喘的发病机制。因此，探究TRPC6与NF-κB、ICAM-1之间的关系将为哮喘发病机制研究开辟新的途径。

4 参考文献

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14Finney-Hayward TK,Popa MO,Bahra P,etal.Expression of transient receptor potential C6 channels in human lung macrophages〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol,2010;43(3):296-304.

15Sel S,Rost BR,Yildirim AO,etal.Loss of classical transient receptor potential 6 channel reduces allergic airway response〔J〕.Clin Exp Allergy,2008;38(9):1548-58.