大豆异黄酮对转基因MMTV-erbB-2小鼠乳腺癌相关激素及受体的效应

宓 伟 郝延璋 衣卫杰 练 武 曲 巍 韩文婷

(滨州医学院营养与食品卫生学教研室，山东 烟台 264003)

我国乳腺癌发病率为8%～12%，并且逐年上升〔1〕。 erbB-2基因过表达是乳腺癌病变因素之一，25%～45%的乳腺癌患者因该基因而发病，更为严重的是该种基因诱发的乳腺癌具有极高的转移率和致死率。有研究显示，饮食和环境因素是影响erbB-2基因过表达的重要原因之一〔2〕。临床认为大豆异黄酮(GST)是肿瘤化学预防重要物质之一，其与肿瘤生成和发展有极大相关性〔3～5〕。本文观察转基因MMTV-erbB-2小鼠进行GST喂养对乳腺癌相关激素及受体的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择体重20～22 g的雌性转基因MMTV-erbB-2小鼠80只，购自南京市江宁区青龙山养殖基地，许可证号：SCXK(苏)2009-0002。于(25±1)℃、RH45%～65%条件下饲养；40只给予GST进行饲养，作为观察组；另40只给予普通饲料(含有玉米、面粉、麸皮等)进行饲养，作为对照组。

1.2方法 两组小鼠分别置于不同笼中，饲养室温20～25℃，12/12 h正常昼夜交替，对照组饲料为：玉米40%，豆粉0%，糖5%，植物油5%，奶粉5%，面粉25%，麸皮20%；观察组饲料为：豆粉40%，面粉25%，麸皮20%，植物油5%，奶粉5%，玉米0%，糖5%。喂养10 w后比较两组小鼠体重、肿瘤发生率、潜伏期；取出未发生肿瘤的完整乳腺组织。

1.3观察指标 每周两次触摸小鼠乳腺，当肿瘤直径大于2 mm时便可检测出，记录摸到肿瘤的日期，计算肿瘤潜伏期，比较检测出肿瘤直径大于2 mm时，两组小鼠体重并计算肿瘤发生率。取出未发生肿瘤乳腺组织后，采用放射免疫法测定未发生肿瘤的乳腺组织中睾酮(T)、雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)、泌乳素(PRL)的含量，分别按放射免疫检测试剂盒说明进行测定。取出未发生肿瘤乳腺组织后，进行Whole mount染色，采取免疫组化技术观察比较两组小鼠未发生肿瘤的乳腺组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达率。其中ER及PR鼠抗人单克隆抗体、PCNA试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。按试剂盒说明书进行操作，采用已知阳性标本切片和实验切片分别进行阳性和阴性对照。ER、PR、PCNA阳性情况判断：ER、PR、PCNA主要存在于细胞核，当ER、PR阳性时表现为细胞核上有黄色或棕色的颗粒；阳性表达百分比(P)分为4个等级，等级1为0%，计0分，以后每个等级增加25%，分值加1；4等级为100%，计4分；阳性表达强度(I)分为3个等级，主要按照细胞染色颜色分级，1级为黄色；2级为棕黄色；3级为棕色。各基因表达水平分值(S)=P×I。S值≥3分即为阳性，其中最高分为12分，S值<3分为阴性。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t和χ2检验。

2 结 果

2.1观察组、对照组小鼠体重、肿瘤潜伏期比较 观察组进食量较小，活动量小，易腹泻，与对照组相比体重减轻(P<0.01)；两组肿瘤潜伏期近似，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 观察组、对照组小鼠体重、肿瘤潜伏期比较

2.2观察组、对照组小鼠肿瘤发生率比较 观察组、对照组共有42只小鼠出现肿瘤，肿瘤总发病率为52.5%；其中观察组中有11只小鼠出现肿瘤，肿瘤发病率为27.5%；对照组中有31只小鼠出现肿瘤，肿瘤发病率为77.5%。观察组肿瘤发生率明显低于对照组(χ2=18.095 2，P=0.000 0)，表明大豆异黄酮能抑制转基因小鼠的肿瘤发生率。

2.3观察组、对照组ER、PR、PCNA阳性率比较(%) 观察组中ER呈阳性小鼠18例(45.0%)；对照组中ER呈阳性小鼠20例(50.0%)；两者相比差异不具有统计学意义(χ2=0.050 1，P>0.822 8)。观察组中PR呈阳性小鼠19例(47.5%)；对照组中PR呈阳性小鼠18例(45.0%)；两者相比差异不具有统计学意义(χ2=0.050 3，P>0.822 6)。观察组中PCNA呈阳性小鼠38例(95.0%)；观察组中PR呈阳性小鼠15例(37.5%)；两者相比差异具有统计学意义(χ2=27.058 0，P<0.000 0)。

2.4观察组、对照组各性激素含量对比 观察组的E2、T、PRL水平显著高于对照组(P<0.05)；观察组的FSH和LH水平显著低于对照组(P<0.01)。见表2。

表2 观察组、对照组各性激素含量对比

3 讨 论

乳腺癌多发于女性人群，具有极高的致死率。临床研究发现，c-erbB-2基因是乳腺癌病变的主要基因之一，该基因也被称为Neu基因或HER-2基因，其受体的细胞胞内具有较高的酪氨酸蛋白激酶活性，可调节细胞增殖、衰亡〔6〕。调查显示，25%～45%的乳腺癌患者因该基因表达过多而发病，并且该种乳腺癌具有肿瘤进展快、恶性程度高、淋巴结转移率高、化疗治疗耐药性高、生存率低等恶性特征〔7〕。目前，乳腺癌防治工作主要建立在早期饮食预防上，通过改善女性人群饮食习惯，增加植物雌激素等物质摄入量可有效降低乳腺癌发病率。

GST是一种具有代表意义的植物雌激素，其是大豆生长过程中形成的一种次级代谢产物，该种代谢产物与雌性激素结构相似〔8〕，可弥补人体雌性激素分泌水平，改善代谢生物学活性、生长因子活性、蛋白质合成，是一种天然的乳腺癌等肿瘤疾病预防剂。GST发挥其类雌激素作用，上调小鼠乳腺组织内E2水平，高水平E2和ER结合，通过诱发细胞内反应激活雌激素应答元件；同时通过提高小鼠体内雌激素效应，产生反馈作用，抑制FSH和LH分泌，并促进PRL分泌〔9〕。

临床研究证明，GST可作用人体基因表达，调节人体细胞凋亡过程进而影响多种肿瘤细胞生成。分析其作用机制可能与诱导DNA 的甲基化和影响雌激素受体途径进而改善组蛋白的乙酰化过程有关〔10〕。此外，GST还可以抑制乳腺癌患者乳腺肿瘤细胞G2向M期转变，同时诱导阻滞在该转变周期内衰亡〔11〕。临床研究认为，乳腺癌患者病发时患者体内通常会被遗传事件影响，而GST可上调 mRNA对 BR-CAL基因的表达，进而抑制乳腺癌病变〔12〕。有学者研究认为，当人体雌性激素偏低时食用GST后，GST可与核内ER结合，形成雌激素样作用〔13〕。本次研究中选用ER、PR作为研究大豆异黄酮的参照数据，主要原因为：ER蛋白是一种2个分子质量的激素结合蛋白分子形成的二聚体，而PR合成必然需要雌性激素启动，也就是说一旦出现PR，ER就必然是活性的，检测ER、PR可有效反映乳腺癌生成、进展和转移情况。

4 参考文献

1侯建峰,冯笑山.植物雌激素干预乳腺癌的研究进展〔J〕.临床肿瘤学杂志，2010；3(1):163-5.

2孙 晶,胡蓓蕾,邬 伟,等.大豆异黄酮对β淀粉样肽介导的大鼠学习记忆损伤及海马ChAT表达的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2010；27(12):135-7.

3全吉淑,程 静,刘春彦,等.大豆异黄酮联合顺铂对A549细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.营养学报，2011；33(5):112-4.

4侯建峰,冯笑山,杨晓鹤,等.转基因雌鼠乳腺癌大豆异黄酮干预效果评价〔J〕.中国公共卫生，2010；26(10):125-7.

5温海霞,孟 毅,庞海燕,等.大豆异黄酮对围绝经期大鼠卵巢组织形态学变化及SPARCmRNA表达的影响〔J〕.中国中医药科技,2012；19(1)：131-5.

6张广平,蔡向前,侯建峰,等.大豆异黄酮在不同的雌激素环境下对MMTV-erbB-2转基因小鼠的作用〔J〕.中华实验外科杂志，2011；28(5):129-31.

7庞海燕,孟 毅,赵 薇,等.大豆异黄酮及主要活性成分Genistein对大鼠卵巢LRH-1基因表达的影响〔J〕.国际遗传学杂志，2012；35(3):164-5.

8Nakoman C,Resmi H,Ay O.Effects of basic fibroblast factor (bFGF) on MMP-2，TIMP-2，and type-Ⅰ collagen levels in human lung carcinoma fibroblasts〔J〕.Biochimie，2005；87(3):186-8.

9周智君,俞远京,丁志刚,等.大豆异黄酮对老龄大鼠雌激素水平和子宫雌激素受体表达的影响〔J〕.中国实验动物学报，2009；17(4)：288-91.

10蔡向前,张广平,李小卉,等.大豆异黄酮在低雌激素环境下对MMTV-erbB-2转基因小鼠的作用〔J〕.中华实用诊断与治疗杂志，2011；25(9):147-8.

11Lee MS,Jung JI,Kwon SH.TIMP-2 fusion protein with human serum albumin potentiates anti-angiogenesis-mediated inhibition of tumor growth by suppressing MMP-2 expression〔J〕.Plos One，2012；7(4):168-71.

12Vasala K,Turpeenniemi-Hujanen T.Serum tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2)and matrix metalloproteinase-2 in complex with the inhibitor (MMP-2:TIMP-2) as prognostic markers in bladder cancer〔J〕.Clini Biochem，2007；40(9-10):640-4.

13甘 萍,李艾珊,聂桂丽,等.多西环素对乳腺癌移植瘤小鼠MMP-2及TIMP-2 mRNA表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(2):162-5.