胃癌患者转化生长因子β1、β2和 β3蛋白的表达水平与预后因素和存活率的相关性

牟卫平 苏世辉 曹 璋

(滨州医学院附属医院消化内科，山东 滨州 256603)

胃癌患者的预后与一些临床和病理指标相关，主要包括肿瘤分期、组织类型、分化程度以及治疗方法等。恶性肿瘤发生过程中，会出现生长因子和细胞因子表达异常，其与肿瘤的发生和预后更为密切；其中最为重要的是转化生长因子(TGF)β〔1〕。TGFβ是一个大的蛋白家族中的成员，包括结构和功能相似的3个成员：TGFβ1、β2和β3〔2〕。体外试验中这三个分子能够通过抑制cyclin-依赖性激酶诱导正常细胞和一些恶性转化的上皮细胞发生细胞生长周期停滞。TGFβ还可以通过失活突变、其相应受体的下调或TGFβ信号转导通路的元件突变起到生长抑制效应。试验表明在结直肠癌患者体内TGFβ1过表达〔3〕，在正常细胞中不表达TGFβ1蛋白和mRNA，还有研究发现胃癌患者TGFβ1的表达水平与肿瘤分期，预后效果有关，并且可以作为独立预后因素〔4〕。本研究观察TGFβ表达与其他典型预后影响因素和存活率的相关性。

1 研究对象和方法

1.1研究对象 我院2005年6月到2008年6月胃癌手术患者110例。纳入标准：所有病例的存档组织，病理记录数据和临床随访数据齐全。手术前没有接受过化疗和放疗，手术方法包括全胃或部分胃切除，胃切除范围依肿瘤位置而定。术后病理分级为以下几类：R0切除(67例)，手术完全切除了肿瘤，在术后组织病理学检验边缘组织中也没有发现有肿瘤微转移迹象， R1切除(31例)：手术中肿瘤完全切除，但在组织病理学检验中发现边缘仍有微肿瘤灶残余。R2切除(12例，病情缓解)：在手术切除的大体标本和病理镜检肿瘤在切除边缘都有残留。排除标准为：患者有其他重要器官的功能不全，有严重的感染，术后出现严重的并发症(出血、吻合口瘘及胰瘘等)或者合并有其他部位的恶性肿瘤及切除时肿瘤已有广泛的腹腔转移。男71例，女39例，年龄25～72(中位数56)岁。见表1。随访期内76.2%(84/110)的病例存活。

表1 TGFβ1、β2和β3表达水平与不同病理学参数的关系

1.2研究方法 该试验为盲法，病理医生在观察病理切除时并不了解相关临床数据。有专人详细记录病理，进行检查，验证病理等级以及肿瘤分期。试验中所有肿瘤均根据恶性肿瘤国际肿瘤分类标准(TNM)进行分期，其中中等或分化良好的肠道腺癌(根据Lauren分类标准)为低恶度肿瘤，而分化不佳的肠道肿瘤以及有扩散腺癌是高恶度肿瘤。术后随访3～42(中位数17)个月，观察患者的生存率。

1.3免疫组化 将手术切除后的胃癌组织和正常非癌胃组织制作成4 μm厚的石蜡切片，进行免疫组化，检测TGFβ1、β2和β3蛋白表达水平。对Ⅲ和Ⅳ期肿瘤患者还要对淋巴结转移组织进行检测，记录原发位点和转移病灶内的3种TGFβ表达水平的差异。将石蜡切片放在覆胶玻片上，使用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。使用1%过氧化氢处理15 min阻断内源过氧化物酶。将玻片放在微波炉中高火处理5 min，重复两次，进行抗原修复。使用标准抗生物素蛋白-生物素检测技术(Multilinkkit;Biogenex,SanRamon,CA)检测抗原。使用的抗体包括有抗TGFβ1、β2和β3的兔源多抗(均按1∶100稀释；Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz,CA)。使用二氨基联苯(Sigma Fast DAB tablets, D-4293,St. Louis, MO)作为显色剂。使用Harris苏木素进行复染。所有步骤均在室温下进行。每步之间均要用PBS漂洗。使用小鼠卵巢切片(Santa Cruz,CA)作为TGFβ1的阳性对照，使用人胎盘组织作为TGFβ2的阳性对照，使用Paget患者的乳房组织作为的阳性对照。试验使用正常兔血清代替一抗作为阴性对照。TGFβ1、β2和β3胞质着色则认为是阳性反应。标本中5%以上的肿瘤细胞出现TGFβ1、β2和β3的胞质着色则认为病例为阳性。

1.4形态学分析 在光学显微镜下对组织切片进行扫描，选择阳性染色区域。使用10×10显微镜网格在400×放大倍数下进行细胞计数。在选中区域计数免疫染色阳性细胞和总细胞数(至少500个细胞)，每张切片要选择5个不同的区域计数。每个区域肿瘤和非肿瘤胃组织中TGFβ1、β2和β3阳性细胞数除以总细胞数得到阳性细胞百分比。同一区域数值大于10%，数值没有差异。然后计算平均得分。

1.5统计学处理 使用单变量方差分析(ANOVA)进行组间比较，评估病理学参数与染色结果之间的关系。如果不符合变量的方差相等或变量不呈正态分布，则使用Kruskal-Wallis非参数检验进行分析。使用Spearman秩相关系数检验TGFβ1、β2和β3之间的关系及 TGFβ2表达水平与患者存活时间之间的关系。使用Kaplan-Meier方法比较生存曲线。后者包括生存率和无病生存率。统计软件为SPSS10.0。

2 结 果

2.1标本免疫组化染色的TGFβ1、β2和β3表达 TGFβ1主要在癌细胞胞质表达。有78例病例肿瘤中有TGFβ1的表达，而正常黏膜和上皮细胞没有TGFβ1的表达。癌细胞中TGFβ2的表达水平明显高于正常上皮细胞(P<0.01)，并且与肿瘤位置，分期和等级无关。正常黏膜和癌细胞中均有TGFβ3的表达。正常黏膜和癌细胞中TGFβ3的表达水平之间没有统计学显著差异(P>0.05)。所有肿瘤中均有TGFβ2和β3表达，在有淋巴结转移的病例中均可检出TGFβ1、β2和β3的表达。晚期肿瘤TGFβ2的表达水平更高(P=0.008)。但TGFβ1和β3并未显示出这种变化趋势。低恶度肿瘤中的TGFβ1表达水平更高(P=0.009)。见表1，图1。肿瘤等级、位置与TGFβ2和β3的表达水平无关， Ⅲ期肿瘤患者TGFβ2和β3的表达水平之间存在直接关系(r= 0.610；P<0.01)，见图2。

2.2TGFβ1、β2和β3表达水平和临床治疗结果之间的关系 TGFβ1的表达能提高患者的无病存活率(图3；P<0.05)和总体存活率(图4；P<0.05)。相反，TGFβ2的表达则会导致患者的存活率下降(r=0.239，P=0.011；图5)。而TGFβ3表达水平则和患者的存活率以及无病存活时间之间没有关系。影响患者生存的独立预后因素主要有肿瘤分期和等级，样本中淋巴结数量，切除范围(R0，R1，R2)，只有TGFβ1可以作为独立预后因素(表2)。

TGFβ1(×400) TGFβ2(×200) TGFβ3(×400)

图2 TGFβ2和TGFβ3表达的关系

图3 TGFβ1表达与无病存活率间的关系

图4 TGFβ1表达与总存活率间的关系

图5 TGFβ2表达与存活时间的相关性

3 讨 论

TGFp是一类多肽类生长因子，对细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、血管的生成、细胞凋亡及机体免疫系统均起着重要的调节作用。在哺乳动物TGF-p有3种:TGFβ1、β2、β3，分别由不同的基因编码〔5〕，具有组织特异性，TGFp信号传导发生障碍，引起包括自身免疫疾病、肿瘤等许多疾病。最近的一些试验主要观察了胃癌中TGFβ1的表达，结果都提示胃癌中TGFβ1 mRNA的表达可能与早期胃癌的预后有关，在病理标本中淋巴结为阴性〔6〕，无肿瘤周围神经束及外膜侵犯的早期胃癌患者肿瘤细胞中的TGFβ1 mRNA的表达提高。这些结果与本试验结果一致，说明低恶度肿瘤中TGFβ1表达水平更高,预后更好。另外，Zhou等〔7〕发现TGFβ1(+)肿瘤患者5年存活率为55.9%，而TGFβ1(-)肿瘤患者5年存活率为67%，说明TGFβ1表达会改善预后。Ma等〔8〕指出TGFβ1表达与预后有关，并且可以作为独立预后指标，同时组织活检样本中TGFβ1 mRNA的水平与患者治疗结果有关，并且可能作为一种新的预后工具。Ma等〔8〕的结果与本试验结果一致，都说明TGFβ1表达水平可以作为一种独立预后因素。TGFβ1在参与肿瘤的发生、发展、转移，这与其在其他恶性肿瘤中的表达模式相似，尤其是与结直肠癌中TGFβ1的表达模式尤为一致。由于TGFβ1特异在癌细胞中活跃合成，因此其参与胃癌的形成〔9〕。低恶度肿瘤中TGFβ1的表达水平高于高恶度的肿瘤。其机制可能与肿瘤TGF-1表达减少时，细胞生长不能停留在G1期，细胞分裂增殖失去控制〔10〕，类上皮样生长因子表达上调，黏膜上皮恶性程度增加有关。因此推测在高恶度胃癌(分化不良的肠道肿瘤或有明显扩散肿瘤)中，还可以有其他机制参与。本研究说明TGFβ2是在肿瘤发展过程中产生的,而非其始动因素。TGFβ3的表达与肿瘤分期和等级之间无关。推测TGFβ3可能不参与肿瘤形成。

先前试验提示TGFβ1基因敲除小鼠会出现多位点炎症疾病〔10〕，这就表明TGFβ1在抑制过度炎症反应中起重要作用。另一方面，TGFβ3/小鼠出现轻度表皮细胞分化缺陷，表现为腭片融合形成唇腭裂。其中TGFβ2缺失的表型最为严重，会导致多种发育缺陷。这些现象提示这3种分子(TGFβ1、β2和β3)在正常发育过程中起到了不同的作用〔11〕，并且这些分子在肿瘤发生过程中也有不同的作用。这也解释了3种分子在肿瘤和正常胃黏膜上皮细胞中表达模式的差异及TGFβ1和β2与患者存活率之间的关系的差异。TGFβ1表达作为独立预后指标，并且在TGFβ1表达缺陷会导致肿瘤恶性程度提高，这就提示低恶性度胃癌的靶向增加TGFβ1的表达可能是一种有效的辅助治疗手段或者是化疗保护策略〔12〕。

总之，胃癌组织中TGFβ 3种异构体存在表达差异，这种差异反映在恶性肿瘤表型和患者存活率上。仍需进一步研究确定这些分子的表达与胃癌进程之间的关系。

4 参考文献

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3Shen Z, Kauttu T, Cao J,etal. Macrophage coculture enhanced invasion of gastric cancer cells via TGF-β and BMP pathways〔J〕.Scand J Gastroenterol, 2013;48(4):466-72.

4Zhang H, Liu L, Wang Y,etal. KLF8 involves in TGF-beta-induced EMT and promotes invasion and migration in gastric cancer cells〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol, 2013;139(6):435-8.

5Ha Thi HT, Lim HS, Kim J,etal. Transcriptional and post-translational regulation of Bim is essential for TGF-β and TNF-α-induced apoptosis of gastric cancer cell〔J〕.Biochim Biophys Acta, 2013;1830(6):3584-92.

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7Zhou H, Wang K, Hu Z,etal.TGF-β1 alters microRNA profile in human gastric cancer cells〔J〕.Chin J Cancer Res, 2013 Feb;25(1):102-11.

8Ma GF, Miao Q, Zeng XQ,etal.Transforming growth factor-β1 and -β2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro〔J〕.PLoS One, 2013;8(1): 542-9.

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10Docea AO, Mitrut P, Grigore D,etal. Immunohistochemical expression of TGF beta (TGF-β), TGF beta receptor 1 (TGFBR1), and Ki67 in intestinal variant of gastric adenocarcinomas〔J〕.Rom J Morphol Embryol, 2012;53(3):683-92.

11Li K, Xia F, Zhang K,etal. Association of a tgf-b1-509c/t polymorphism with gastric cancer risk: a meta-analysis〔J〕.Ann Hum Genet, 2013;77(1):1-8.

12Jiang CG, Lv L, Liu FR,etal. Connective tissue growth factor is a positive regulator of epithelial-mesenchymal transition and promotes the adhesion with gastric cancer cells in human peritoneal mesothelial cells〔J〕.Cytokine, 2013;61(1):173-80.