miR-21抑制物对A549细胞球增殖的影响及机制

胡欣春 魏益平 喻东亮 彭金华 徐建军

(南昌大学第二附属医院心胸外科，江西 南昌 330006)

肺癌的高死亡率主要是因为化疗仅能杀灭对化疗药物敏感的肿瘤细胞，而无法有效杀灭天然耐药或通过突变获得耐药能力的肿瘤细胞〔1〕,使得肿瘤出现复发和耐药，最终导致治疗的失败。近年来的研究证实这一类亚群肿瘤细胞不仅具有耐药的能力，还具有自我更新、再生等干细胞特性，故被称为肿瘤干/祖细胞〔2〕。故如何杀灭肿瘤干细胞成为治疗肿瘤的关键。目前研究认为miRNA在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用〔3〕。miR-21定位于17q23.2染色体FRA17B脆性区上，在肺癌〔4〕、肝癌〔5〕等多种组织、细胞中发挥促癌作用，但miR-21在肿瘤干细胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨miR-21对富含肺癌干细胞的A549细胞球增殖的影响以及可能的机制。

1 材料与方法

1.1主要材料 F12K培养基、胎牛血清、表皮生长因子(EGF), 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和opti-Mem购自Gibcol公司；B27、胰岛素购自Sigma公司；APC标记抗人CD133/1(AC133)抗体购自Miltenyi Biotec公司；FITC标记抗人CD44抗体购自BD公司；TRIzol购自Invirogen公司；无血清培养基(SFM)：F12K+胰岛素(4 U/L)+ B27(1倍)+ EGF(20 μg/L)+ bFGF(20 μg/L), 总RNA提取试剂盒购自东洋纺公司， HairpinitTMmiRNAs定量PCR试剂盒购自吉玛公司。M-PER细胞裂解液购自赛默飞世尔公司。DKK2和β-catenin单克隆抗体均购自Abcam公司，β-actin购自北京天德悦公司。ribo FECTTM CP转染试剂、miR-21抑制物、miR-21阴性对照物均购自广州锐博公司。MTT试剂盒购自江苏碧云天公司。

1.2方法

1.2.1肺癌A549细胞的培养 A549细胞培养于含有10%胎牛血清的F12K培养基中，细胞置于37℃、5% CO2、饱和湿度下的培养箱中传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2A549细胞球的培养 将A549细胞以200个/孔接种到6孔板中，待其长成克隆后将其消化，置于含有适量SFM的超低黏附培养瓶中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度下的培养箱中培养。2 w后观察到细胞形成多细胞球体悬浮于培养基中，收集多细胞球体重置于胰蛋白酶中消化，将细胞球体吹散成为单细胞，离心洗涤后，接种于SFM中继续培养，扩增至第2代多细胞球体形成并应用相关实验〔6〕。

1.2.3流式细胞术检测细胞CD133+、CD44+的表达 收集107个细胞后用含有2% FBS的PBS重悬，3 000 r/min离心10 min后弃去上清，加入80 μl缓冲液后，加入10 μl CD133/L(AC133)抗体和20 μl CD44抗体，充分混匀后置于4℃避光孵育15～20 min。加入1 ml缓冲液后3 000 r/min离心10 min后弃去上清，加入200 μl 缓冲液重悬细胞后，上机检测。

1.2.4实验分组 实验分为(1)A549细胞球组：未经处理；(2) IHN组：miR-21抑制物转染A549细胞球；(3)IHN-NC组：miR-21抑制物阴性对照物转染A549细胞球。

1.2.5miR-21抑制物和阴性对照物的转染 miR-21抑制物的序列为：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′，为化学修饰的成熟miR-21互补单链。抑制物阴性对照物的序列为:5′-CAGUACUUUUGUAGUACAA-3′。将抑制物和阴性对照物干粉用RNase-free H2O 配制成20 μmol/L的储存液后，分装、冻存备用。miR-21抑制物转染悬浮细胞的方法按照广州锐博公司riboFECTTMCP转染试剂说明书进行操作：(1)将A549 sphere用胰酶消化，并将细胞球体吹散成为单个细胞，离心洗涤后用SFM重悬，在每孔含有440 μl SFM培养基的24孔板中接种约3×105个/孔细胞；(2)将5 μl 浓度为20 μmol/L 的miR-21抑制物加入到50 μl 1×riboFECTTMCP缓冲液中，轻轻混匀，室温孵育5 min；(3)在上述混合液中加入5 μl转染试剂ribo FECTTM CP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育15 min；(4)将60 μl转染试剂-抑制物混合试剂加入含有细胞的孔板中，轻轻混匀，miR-21抑制物的转染终浓度为200 nmol/L；(5)将培养板置于37℃、5% CO2、饱和湿度下的培养箱中培养48 h后进行PCR和Western印迹检测(MTT检测的时间点为12、24、48 h)。miRNA-21阴性对照物组的转染：取50 μl 1×riboFECTTMCP缓冲液稀释1.25 μl 20 μmol/L miRNA 阴性对照物贮存液，余步骤同miR-21抑制物的转染步骤。

1.2.6miRNA-21在细胞中的表达检测 按照TRIzol提取总RNA试剂盒说明书提取细胞的总RNA。逆转录条件为25℃ 30 min， 42℃ 30 min，85℃ 10 min，逆转录试剂由吉玛公司提供。cDNA采用SYBR Seclect Master Mix系统进行实时荧光定量PCR检测miR-21的表达，以U6作为内参。引物序列见表1。每个待测基因设4个复孔。数据通过Sequence detection software 1.3系统进行处理，按照公式RQ=2-△△CT计算各组间的倍数关系。

1.2.7Western印迹检测DKK2和β-catenin 蛋白的表达 收集细胞，加入300 μl M-PER细胞裂解液，置于冰上20 min，期间吹打多次，经4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液。测浓度后，蛋白煮沸变性。制备SDS-PAGE凝胶，每孔加样40 μg进行电泳。250 mA湿转86 min，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉中室温封闭1 h后分别加入抗人DKK2(1∶300)、β-catenin (1∶1 000)及兔抗β-actin抗体(1∶10 000)的抗体稀释液中4℃过夜，用TBST洗涤3次，5 min/次，后放入二抗(辣根酶标记山羊抗兔，1∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次5 min，用ECL化学发光法检测DKK2、β-catenin、β-actin蛋白的表达水平。使用Image-Pro Plus10.0分析蛋白条带图片，，以同一标本β-actin的产物光密度值作为内参，校正各自目的蛋白的积分光密度值。

表1 引物序列

1.2.8MTT检测细胞增殖 取生长良好的A549细胞球消化成细胞悬液，计数并将细胞浓度调整到3×103/孔，接种于96孔板后加入SFM培养液。培养48 h后换液，每孔加入10 μl(5 mg/ml)的MTT溶液，孵育4 h后，每孔加入100 μl Formanzan溶液，继续孵育直至显微镜下观察到Formanzan全部溶解。用酶标仪检测各孔吸光度(OD570 nm值)，空白孔调零。

1.3统计学处理 使用SPSS13.0进行t检验。

2 结 果

2.1A549细胞球中CD133+CD44+的阳性率 流式细胞术检测示A549细胞球中 CD133+CD44+的阳性率为65.800%。 A549细胞中CD133+CD44+的阳性率为0.577%。

2.2DKK2、β-catenin蛋白在A549细胞球和A549细胞中的表达 DKK2蛋白在A549细胞球中的表达下调至A549细胞中的0.50±0.06倍(P<0.05)，而β-catenin蛋白在A549细胞球中的表达是A549细胞的1.72±0.06倍(P<0.05)。见图1。

图1 Western印迹检测DKK2、β-catenin蛋白在A549细胞球和A549细胞中的相对表达

2.3免疫迎迹检测不同处理条件下miR-21在A549细胞球以及A549细胞中的表达 miR-21在A549细胞球组、IHN-NC组以及IHN组中的表达分别是A549细胞组的4.13±0.02、4.00±0.10、2.13±0.25倍(P<0.05)；A549细胞球转染miR-21抑制物后(IHN组)，miR-21的表达分别低至A549细胞球组、IHN-NC组的(51±6)%、(53±7)%，显著低于A549细胞球组、IHN-NC组(P<0.05)；A549细胞球组与IHN-NC组的miR-21无显著差异(P>0.05)。

2.4DKK2 蛋白在不同处理条件下A549细胞球中的表达 A549细胞球转染miR-21抑制物后(IHN组)，DKK2蛋白的表达分别是A549细胞球组、IHN-NC组的2.13±0.20、2.06±0.16倍，显著高于A549细胞球组、IHN-NC组(P<0.05)；A549细胞球组与IHN-NC组的DKK2蛋白表达无显著差异(P>0.05)。见图2。

2.5β-catenin蛋白在不同处理条件下A549细胞球中的表达 IHN组β-catenin蛋白的表达降低至A549细胞球组和IHN-NC组的(61±4)%、(59.8±5)%,显著低于A549细胞球组、IHN-NC组(P<0.05)；A549细胞球组与IHN-NC组的DKK2蛋白表达无显著差异(P>0.05)。见图3。

2.6不同处理时A549细胞球的抑制率 IHN组和IHN-NC组在12、24、48 h时抑制率显著高于A549细胞球组(P<0.05)，IHN组在24、48 h时相点抑制率明显高于IHN-NC组(P<0.05)。见图4。

图2 Western印迹检测DKK2蛋白在A549细胞球不同处理条件下的相对表达

图3 Western印迹检测β-catenin蛋白在A549细胞球不同处理条件下的相对表达

与A549细胞球组比较：1)P<0.05；与IHN-NC组比较：2)P<0.05

3 讨 论

肿瘤干细胞理论认为肿瘤的发生是肿瘤干细胞分化的结果，肿瘤干细胞对肿瘤的形成、进展、转移及复发起着关键作用〔7〕。肿瘤干细胞大多处于相对静止状态，使其对放化疗并不敏感，导致大部分肿瘤难以治愈或复发。所以，治疗肿瘤的关键在于对肿瘤干细胞的治疗。本研究应用无血清培养成功培养出A549细胞球。而Ye等〔8〕的研究认为A549细胞球具有自我更新、更高增殖能力等肺癌干细胞的特性，为进一步研究miR-21在肺癌干细胞中的作用奠定了基础。

LI等〔9〕的研究指出在对EGFR酪氨酸激酶抑制药物敏感的肺癌细胞PC9R中，miR-21的过表达可导致该细胞对EGFR酪氨酸激酶抑制药物的耐受。而其他研究同样证实miR-21在肿瘤细胞中的过表达可增强肿瘤对化疗药物的耐受性〔10〕。上述研究提示miR-21在肿瘤中发挥着关键作用。本研究中miR-21在A549细胞球中的表达较A549细胞中显著升高，提示miR-21在A549细胞球中发挥一定的作用。Yu 等〔11〕研究指出miR-21过表达可显著增强结肠癌HT-116 干细胞球中过形成细胞球的能力以及在裸鼠皮下的成瘤能力，进一步研究证实miR-21通过调控RECK、TIMP3等多个基因，促进神经胶质瘤的侵袭、迁移和凋亡〔12〕。而在乳腺癌MCF-7细胞中，miR-21调控bcl-2等基因促进肿瘤的生成〔13〕。Zhang 等〔14〕的研究指出在A549细胞中抑制miR-21的表达，可上调PTEN，导致A549细胞的凋亡增加和侵袭能力的降低。本研究发现，转染miR-21抑制物后，A549细胞球的细胞抑制率显著增高，提示miR-21可以调控A549细胞球的增殖。其调控A549细胞球的机制:(1)抑制miR-21，可上调其靶基因PTEN〔14〕、PDCD4(Programmed Cell Death4)〔15〕、TIMP3〔16〕等抑癌基因；(2)通过调控增殖相关信号通路。MiR-21可直接调控DKK2〔17〕，或通过作用于TGFβ2靶点调节TCF〔11〕等Wnt信号通路反应元件，调控细胞增殖。

Dickkopf (DKK)是一种分泌蛋白，其家族有4种蛋白，主要作用是通过与Wnt受体LRP5/6及跨膜蛋白Keremen1/2结合，形成复合体并诱导细胞快速内吞该复合体，以减少细胞膜上LRP5/6，阻断Wnt信号从胞内传递，抑制β-catenin入核发挥生物学效应〔18〕。研究表明DKK2的缺失与多种肿瘤的发生、发展有着密切关系〔19〕。本研究中当A549细胞球转染miR-21抑制物后，DKK2蛋白表达上调，这与文献〔17〕报道一致，提示DKK2可能是miR-21的靶点。在DKK2蛋白表达上调的同时，β-catenin蛋白表达明显下调，说明DKK2抑制了Wnt信号通路，与文献〔18〕报道一致。上述结果提示miR-21可能通过作用于靶点DKK2，调控Wnt信号通路，从而导致A549细胞球增殖能力的改变。

4 参考文献

1Dalerba P, Cho RW, Clarke MF. Cancer stem cells: models and concepts〔J〕. Annu Rev Med, 2007;58: 267-84.

2Malanchi I, Santamaria-Martinez A, Susanto E,etal. Interactions between cancer stem cells and their niche govern metastatic colonization〔J〕. Nature, 2012;481(7379): 85-9.

3Cho WC. MicroRNAs in cancer - from research to therapy〔J〕. Biochim Biophys Acta, 2010;1805(2): 209-17.

4Gao W, Shen H, Liu L,etal. MiR-21 overexpression in human primary squamous cell lung carcinoma is associated with poor patient prognosis〔J〕. J Cancer Res Clin Oncol, 2011;137(4): 557-66.

5Xu G, Zhang Y, Wei J,etal. MicroRNA-21 promotes hepatocellular carcinoma HepG2 cell proliferation through repression of mitogen-activated protein kinase-kinase 3〔J〕. BMC Cancer, 2013;13: 469.

6孙芬芬，贺斌峰，余时沧，等. A549肺癌细胞球抗凋亡能力及耐药蛋白表达分析〔J〕. 肿瘤, 2011；21(2): 111-6.

7Kratz JR, Yagui-Beltran A, Jablons DM. Cancer stem cells in lung tumorigenesis〔J〕. Ann Thorac Surg, 2010;89(6): S2090.

8Ye XQ, Li Q, Wang GH,etal. Mitochondrial and energy metabolism-related properties as novel indicators of lung cancer stem cells〔J〕. Int J Cancer, 2011;129(4): 820-31.

9Li B, Ren S, Li X,etal.MiR-21 overexpression is associated with acquired resistance of EGFR-TKI in non-small cell lung cancer〔J〕. Lung Cancer, 2014:83(2):146-53.

10胡 婷，陈梅香，翁泽平，等. miR-21通过下调PTEN增强人脑胶质瘤细胞对卡莫司汀耐药〔J〕. 中国病理生理杂志, 2012(8): 1345-51.

11Yu Y, Kanwar SS, Patel BB,etal. MicroRNA-21 induces stemness by downregulating transforming growth factor beta receptor 2 (TGFbetaR2) in colon cancer cells〔J〕. Carcinogenesis, 2012;33(1): 68-76.

12Gabriely G, Wurdinger T, Kesari S,etal. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators〔J〕. Mol Cell Biol,2008;28(17): 5369-80.

13Si ML, Zhu S, Wu H,etal. miR-21-mediated tumor growth〔J〕. Oncogene, 2007;26(19): 2799-803.

14Zhang W, Bai W, Zhang W. MiR-21 suppresses the anticancer activities of curcumin by targeting PTEN gene in human non-small cell lung cancer A549 cells〔J〕. Clin Transl Oncol, 2013nov 2P.〔Epub ahead of print〕.

15Yao Q, Xu H, Zhang QQ,etal. MicroRNA-21 promotes cell proliferation and down-regulates the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) in HeLa cervical carcinoma cells〔J〕. Biochem Biophys Res Commun, 2009;388(3): 539-42.

16Zhu S, Si ML, Wu H,etal. MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1)〔J〕. J Biol Chem, 2007;282(19): 14328-36.

17Kawakita A, Yanamoto S, Yamada SI,etal. MicroRNA-21 Promotes Oral Cancer Invasion via the Wnt/beta-Catenin Pathway by Targeting DKK2〔J〕. Pathol Oncol Res, 2013；〔Epub ahead of print〕.

18Mao B, Wu W, Davidson G,etal. Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta-catenin signalling〔J〕. Nature, 2002;417(6889): 664-7.

19Caldwell GM, Jones C, Gensberg K,etal. The Wnt antagonist sFRP1 in colorectal tumorigenesis〔J〕. Cancer Res, 2004;64(3): 883-8.