转化生长因子β1对大鼠血管平滑肌细胞Smurf2和Ⅰ型胶原表达的影响

刘怡菲 褚昀赟 岑畅飞 刘先哲

(三峡大学人民医院，湖北 宜昌 443002)

转化生长因子β1(TGF-β1)作为强大的促纤维化细胞因子，与平滑肌细胞(SMCs)上受体结合活化胞内Smad信号通路，刺激细胞外基质(ECM)合成〔1〕，增加动脉粥样斑块的稳定性。Smad泛素调节因子2(Smurf2)是泛素连接酶E3 HECT家族成员，其能干扰TGF-β1细胞内经典的Smad信号转导途径中多个环节阻断TGF-β1信号转导〔2〕，从而减弱 TGF-β1纤维化作用。虽然Raines等〔3〕肾纤维化疾病中研究发现在肾小管上皮细胞中TGF-β1促进Smurf2基因和蛋白的表达水平，但在血管平滑肌细胞(VSMCs)中二者之间的关系尚未阐明。本实验选择以动脉粥样硬化为背景，研究在VSMCs中TGF-β1对Smurf2的作用，探讨不同浓度TGF-β1对Smurf2以及其后续产物ECM中Ⅰ型胶原(ColⅠ)的影响。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠VSMCs A7r5(中科院上海细胞库)。低糖DMEM培养基、胎牛血清(FCS)(美国Gibco)，TGF-β1(广州奕源生物科技有限公司)，胰蛋白酶-EDTA(武汉博士德生物工程有限公司)，反转录试剂盒(大连TAKARA公司)，GoTaq GreenMaster Mix(美国Promega),TRIzol(上海华舜)，Smurf2引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，兔抗大鼠Smurf2抗体(美国Santa Cruz公司),辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中山公司)，大鼠ColⅠ ELISA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 A7r5用含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5% 二氧化碳(CO2)恒温条件下培养。取对数生长期细胞用于试验。随机分为：对照组(不含干预因素的正常培养的细胞)、TGF-β1(1、5、10 μg/L)3种浓度分别刺激24 h，每组均为4瓶细胞。

1.2.2RT-PCR法检测A7R5细胞中Smurf2 mRNA的表达量 根据 Trizol RNA说明书提取细胞总RNA。根据GenBank内的序列，采用Primer Premier5.0设计引物，序列如下：Smurf 2引物：正链 5′-GGG AAC GCC CAA CAA GAC-3′，反链 5′-ATT GCG GAT CTC CCA CCC-3′，368 bp；β-actin正链：5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，反链：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′，375 bp，逆转录条件按说明书操作即可。PCR扩增条件：94℃预变性5 min、94℃变性35 s、56℃复性35 s，72℃延伸45 s条件扩增30次。72℃补充延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以1 000 bp DNA梯度标记上样作为分子量标记；以UVP凝胶图像扫描系统测目的基因与β-actin吸光度A比值，设对照组为1，试验重复3次。

1.2.3Western印迹检测Smurf2蛋白的表达 用4℃预冷的PBS洗细胞3次，加入300 μl含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，置于冰上30 min，收刮细胞，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA法测蛋白质浓度。各组取50 μg待测蛋白质样本，与蛋白质分子量标准品共同进行SDS-PAGE电泳，聚丙酰胺的积层胶浓度为5%，分离胶浓度为8%，将蛋白质转移至PVDF膜上，置5%脱脂奶粉封闭缓冲液中37℃ 60 min，TBS漂洗后分别加入兔抗大鼠Smurf 2抗体(1∶500)，4℃过夜用TBS漂洗，充分洗膜后与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶3 000)37℃ 60 min，然后用TBS漂洗，ECL法显色，X光胶片曝光显影。试验重复3次。

1.2.4ELISA测细胞培养物上清中ColⅠ的表达 提取细胞上清液，10 000 r/min离心10 min除颗粒和聚合物，将标本放于-20℃或-80℃保存，用ELISA定量测定ColⅠ的浓度,按说明书操作即可。

1.3统计学分析 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1TGF-β1对大鼠VSMCs Smurf2 mRNA水平的影响 对照组有一定量的Smurf2 mRNA表达(0.264 8±0.008 74)，用TGF-β1(1、5、10 μg/L)分别刺激大鼠VSMCs 24 h后， Smurf2 mRNA的表达明显减弱(0.240 5±0.009 42、0.180 8±0.014 83、0.131 4±0.007 43)，分别下降9.177%、31.722%和50.378%，且呈剂量依赖性，与对照组比较有显著差异(P<0.05)，见图1。

1：对照组； 2：TGF-β1(1 μg/L)； 3：TGF-β1(5 μg/L)； 4：TGF-β1(10 μg/L)，下图同

2.2TGF-β1对大鼠VSMCs Smurf2蛋白表达的影响 对照组有一定量的Smurf2蛋白表达，用TGF-β1(1、5、10 μg/L)刺激大鼠VSMCs 24 h后， Smurf2蛋白的表达均明显降低，与对照组比较，分别下降了14.78%、18.63%和35.28%(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见图2。

图2 不同浓度TGF-β1作用下Smurf2和内参蛋白免疫印迹结果

2.3TGF-β对大鼠VSMCs ColⅠ表达的影响 不同浓度TGF-β1作用于大鼠VSMCs 24 h后，ELISA检测细胞上清液中ColⅠ蛋白的表达量发现：同对照组相比，不同浓度TGF-β1作用下ColⅠ蛋白表达量均升高，分别是对照组的1.276 8、121.448 5和1.635 5倍(P<0.01)，见图3。

图3 Ⅰ型胶原标准曲线

3 讨 论

既往的研究表明VSMC，是动脉粥样硬化斑块中最主要的细胞成分，各种生长因子对VSMC，转型、增殖的调节已成为动脉粥样硬化发病机制研究的热点〔4〕。Stefroni等〔4〕通过做血透发现伴有冠心病的患者血中TGF-β1水平明显低于无冠心病的患者，血TGF-β1水平每降低1 μg/L，心血管疾病相关威胁性增加9%，表明TGF-β1水平降低是导致动脉粥样硬化的独立威胁因子。进一步研究发现TGF-β1是强大的催纤维化因子，可刺激VSMCs产生ECM，增加纤维帽厚度〔1〕。这些研究结论与本研究结果是一致的。

Smurf2是C2-WW-HECT 结构域的E3 泛素连接酶家族的一员，在多种生物过程中扮演重要角色。Smurf2能干扰TGF-β1信号转导途径的多个重要环节阻断其信号转导〔5〕。高表达的Smurf2能降低TGF-βRI的表达水平〔6〕，最近研究表明TGF-βRⅡ也可以被Smurf2降解〔7〕。Smurf2能与Smad 2的脯-酪氨酸(PPXY)序列紧密结合,通过HECT结构域催化降解Smad 2。虽然Smad4分子的序列中没有PPXY模序,当Smurf2与I-Smad共同存在时,Smad 4与Smad 7通过各自的MH2区相结合,由Smad7介导其多泛素化而降解〔8～12〕。Smurf2通过对TGF-β1胞内Smad通路精细复杂地调节影响其细胞外基质的合成，在维持动脉粥样斑块的稳定性中起重要作用。

本研究结果显示TGF-β1可抑制VSMCs中Smurf2的表达，促进ColⅠ的表达。TGF-β1作为动脉粥样硬化中的保护因子，随浓度的升高逐渐促进ColⅠ的产生，与以往文献报道相符〔1，13〕，并随浓度依赖性抑制Smurf2表达，由此推断在VSMCs中，TGF-β1提高其信号强度，增加ECM的产生，抑制Smurf2的表达可能是其作用机制的一种。

4 参考文献

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11Ohashi N，Yamamoto T，Uchida C,etal.Transcriptional induction of Smurf2 ubiquitin ligase by TGF-beta〔J〕.FEBS Lett，2005；579(12):2557-63.

12Tan RY，He WC，Lin X,etal.Smad ubiquitination regulatory factor-2 in the fibrotic kidney：regulation，target specificity and functional implication〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2008；294(5)：F1076-83.

13Mallat Z,Gojova A,Marchiol-Fournigault C,etal.Inhibition of transforming growth factor-beta signaling accelerates atherosclerosis and induces an unstable plaque phenotype in mice〔J〕.Circ Res,2001；89(10):930-4.