ERK1/2在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病过程中的组织特异性作用

赵振华 刘昌云 李永坤 李云飞 张 旭 雷惠新

(福建省立医院 福建医科大学省立临床学院神经内科，福建 福州 350001)

多发性硬化(MS)最常累及的部位为脑室周围白质、视神经、脊髓、脑干和小脑〔1〕。MS的病因及发病机制尚不明确，可能与病毒感染、自身免疫反应，遗传因素、环境因素等有关，其中自身免疫反应占重要地位〔2,3〕。MOG诱导建立的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的临床表现及中枢神经系统炎症浸润和脱髓鞘的组织病理表现与MS相似，已成为国际上研究MS的主要模型〔4〕。细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在自身免疫性疾病中的作用还不清楚，且存在争议。本研究旨在研究该途径在EAE的发病的不同时期，在不同的组织中表达情况，进一步探讨该途径在EAE发生过程中的作用。

1 材料和方法

1.1实验动物及试剂 雌性C57BL/6小鼠10只，8～10周龄，体重(18±2)g ，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。鼠源的MOG35-55 多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由上海生物工程有限公司合成，纯度为DHPLC>97%，完全弗氏佐剂(CFA)和灭活的结合杆菌(H37Ra)均购自Difco公司，百日咳毒素购自Sigma公司。

1.2模型诱导 将抗原MOG35-55多肽稀释成300 μg/50 μl，按1∶1加入等量完全弗氏佐剂,并将结核杆菌含量补充至5 mg/ml混合,充分乳化后按每只100 μl于小鼠腋窝皮下注射。免疫当天及24 h后经小鼠尾静脉注射100 μl含200 ng百日咳毒素的PBS。PBS对照组则用PBS代替抗原，余同EAE组小鼠的诱导。

1.3神经功能评分 自免疫诱导当日起开始测量小鼠的体重，并采用双盲法进行神经功能评分，具体评分标准如下〔5〕：0级，无临床表现；1级，精神委靡，尾部无力；2级，行走步态异常，双后肢无力；3级，双后肢瘫痪；4级，双后肢瘫痪伴一侧或者两侧前肢瘫痪；5级，濒死或者死亡。

1.4组织取材与病理学分析 在EAE模型发病的初期以及高峰期，将小鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，取其颈膨大及腰膨大处的脊髓，置于4%的多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片，HE和固兰染色观察〔6〕。

1.5Western印迹 小鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，取出脊髓及淋巴结，冰浴下匀浆，加入蛋白酶抑制剂和细胞裂解液充分吹打混匀后，4℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清，分装。以小牛血清作为标准品蛋白，采用Bradford 方法在分光光度计上进行蛋白定量。SDS PAGE采用4%积层胶，10%分离胶，上样量为80 μg，以12 V/cm电压分离蛋白后取出凝胶电转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入单克隆抗体(P-ERK1/2、ERK1/2、P-MEK1/2、MEK1/2)4℃孵育过夜，TBST漂洗5 min×3次后，加入带有辣根过氧化物酶的相应Ⅱ抗室温孵育1 h，增强化学发光法显示蛋白质条带。将胶片结果扫描，用Bio Rad公司Quantity-One 软件进行条带灰度值分析。采用GAPDH作为内参对照。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0 软件行t检验。

2 结 果

2.1临床表现 如图1所示，对照组小鼠无发病，EAE组小鼠均有发病。EAE组小鼠在免疫后(13.6±2.1)d起病，临床表现为精神萎靡、尾部张力减弱或消失。随着病情发展且症状逐渐加重，出现双后肢无力拖地、共济失调等。在免疫后(17.0±2.8)d，EAE组小鼠病情发展到高峰，上肢也出现无力，严重者出现四肢瘫甚至死亡，高峰期临床评分为(2.8±1.1)分。

2.2病理表现 HE染色显示EAE 组小鼠脊髓实质中均有炎性细胞浸润，但病变分布以脊髓颈腰膨大为主,表现为大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润,浸润沿包膜和小血管由外向内延伸，小血管周围可见血管套形成。固兰染色可见在炎症浸润区域，脊髓白质中有大小不等的片状髓鞘脱失区，髓鞘纤维疏松，大量空泡形成。对照组小鼠脊髓均未见明显异常改变(图2)。

2.3ERK1/2蛋白的磷酸化参与EAE的发生 无论是发病前还是在发病高峰期，EAE组小鼠淋巴结中的ERK1和ERK2的磷酸化均被明显抑制。如图3A所示，发病前期的EAE组小鼠淋巴结未见明显磷酸化的ERK1/2表达。如图3B所示，发病高峰期的EAE组有少量磷酸化的ERK1/2表达，与对照组相比，两者间的差别有统计学意义(0.10±0.07 vs 0.83±0.22，P=0.012)。EAE组小鼠脊髓中的MEK1/2的磷酸化与对照组相比均无明显差异。如图4A所示，发病前期EAE组小鼠淋巴结的磷酸化MEK1/2的表达与PBS对照组相比差别无统计学意义(0.52±0.21 vs 0.47±0.08,P=0.710)。如图4B所示，发病高峰期EAE组小鼠淋巴结的磷酸化MEK1/2的表达与PBS对照组相比差别也无统计学意义(0.62±0.06 vs 0.59±0.19,P=0.789)。

对各组小鼠脊髓的中的ERK1/2的磷酸化情况进行检测，发现无论是发病前还是在发病高峰期，EAE组小鼠脊髓中的ERK1和ERK2的磷酸化与PBS对照组相比均无明显差异。如图5A所示，发病前期EAE组小鼠脊髓的磷酸化ERK1/2的表达与PBS对照组相比差别无统计学意义(0.88±0.99 vs 0.47±0.25,P=0.527)。如图5B所示，发病高峰期EAE组小鼠脊髓的磷酸化ERK1/2的表达与PBS对照组相比差别也无统计学意义(2.51±1.8 vs 10.18±8.18,P=0.244)。

图1 EAE组和对照组小鼠的临床评分

图2 EAE组和对照组小鼠脊髓切片HE和固兰染色结果

图3 EAE组和对照组小鼠淋巴结ERK1/2表达

图4 EAE组小鼠和对照组小鼠淋巴结的MEK1/2表达情况

图5 EAE组和对照组小鼠脊髓ERK1/2的表达

3 讨 论

MS的发病机制复杂多样，但免疫机制仍然占主要地位，而EAE作为其免疫机制的小鼠模型，则主要是由于CD4+T细胞介导，ERK1/2是将信号从细胞表面受体传导至细胞核的关键，被认为是经典的MAPK信号通路。近年来研究发现，ERK1/2信号通路的激活能促进T淋巴细胞的活化、增殖并抑制其凋亡，这可能为T淋巴细胞相关的免疫性疾病的治疗提供了新的策略。

尽管近几年，关于ERK1/2途径研究已越来越多，但是ERK1/2在自身免疫性疾病中的作用还不清楚，且存在争议。Nekrasova等〔7〕研究发现，用MOG35-55诱导ERK1基因缺陷小鼠建立的EAE小鼠模型中，T细胞的增殖和细胞因子的产生并没有受到影响，而且所诱导的EAE小鼠脾脏的T淋巴细胞同样具有致病性，但是ERK1基因缺陷小鼠具有EAE易感性，ERK1与EAE的发生有关。他们认为ERK1与T细胞的成熟、活化、分化无关，ERK2可能可以在ERK1缺乏时发挥作用，具体还不清楚。由于ERK2基因敲除小鼠在胚胎期就会死亡，因此关于ERK2功能的研究还有待进一步研究。同样是用MOG35-55诱导ERK1基因缺陷小鼠建立的EAE小鼠模型，Agrawal等〔8〕研究却显示ERK1基因的缺失会导致Th1细胞极化， IFN-γ的生成增多，影响了Th1细胞和Th2细胞的平衡，从而导致EAE的易感性提高。除了用环境不同对EAE的影响不同来解释这个差别，目前还没有更好的解释。除了基因小鼠外，多数ERK1和ERK2的功能的研究是建立在MEK1/2的抑制剂上，不区分ERK1和ERK2两个单体，其结果与基因敲除存在差异。Brereton等〔9〕用MEK1/2 的抑制剂U0126来抑制EAE小鼠体内的ERK的活化，结果发现EAE的严重程度降低。在本研究中，无论是在发病前还是发病的高峰期，在EAE小鼠的淋巴结中ERK1和ERK2的表达与正常小鼠相比没有变化，且ERK1/2的上游激酶的磷酸化水平也没有发生变化，但是ERK1和ERK2的磷酸化均受到抑制，由此我们认为，ERK1和ERK2在EAE的发病过程中都起到了一定的作用，这种作用可能是二者共同作用的结果，二者可能共同参与EAE的始动。由此可见，ERK1和ERK2在EAE的发病过程中并未起到决定作用。不管是在发病前期和发病高峰期，EAE小鼠的淋巴结中ERK1和ERK2的磷酸化水平都受到明显的抑制，可见ERK1和ERK2在淋巴结中的磷酸化情况与疾病的发病程度没有明显的关系，抑制淋巴细胞中ERK1和ERK2的磷酸化并不能增加EAE的发生。尽管如此，在脊髓中，无论是否发病，无论发病严重程度，ERK1和ERK2及其磷酸化水平均未见明显变化。由此，我们发现本研究的结果与上述研究者的结论存在差别，我们认为ERK1/2途径在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病过程中的组织特异性作用，而造成这种差别的主要原因可能是，不管是基因敲除还是抑制剂，都是从整体去研究，影响到全身各个器官和组织，而ERK1和ERK2蛋白功能可能具有组织特异性，且可能不是孤立的发挥作用，而是受到其他因素的影响，还有待于进一步研究探讨。

4 参考文献

1Compston A, Coles A. Multiple sclerosis〔J〕. Lancet, 2008; 372(9648): 1502-17.

2Zhang GX, Yu S, Gran B,etal. T cell and antibody responses in remitting-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis in (C57BL/6 × SJL) F1 mice〔J〕. J Neuroimmunol, 2004; 148(1-2):1-10.

3Yan SS, Wu ZY, Zhang HP,etal. Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by selective blockade of encephalitogenic T-cell infiltration of the central nervous system〔J〕. Nat Med, 2003; 9(3):287-93.

4Rao P, Segal BM. Experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.Methods Mol Med,2004; 102:363-75.

5Okuda Y, Okuda M, Claude C,etal. Gender does not influence the susceptibility of C57BL/6 mice to develop chronic experimental autoimmune encephalomyelitis induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein〔J〕. Immunol Lett, 2002; 81(1): 25-9.

6Slavin A, Ewing C, Liu J,etal. Induction of a multiple sclerosis-like disease in mice with an immunodominant epitope of myelin oligodendrocyte glycoprotein〔J〕. Autoimmunity, 1998; 28 (2): 109-20.

7Nekrasova T, Shive C, Gao Y,etal. ERK1-deficient mice show normal T cell effector function and are highly susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕, J Immunol, 2005;175(4):2374-80.

8Agrawal A, Dillon S, Denning TL,etal. ERK1-/-mice exhibit Th1 cell polarization and increased susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕. Immunol, 2006; 176(10): 5788-96.

9Brereton CF, Sutton CE, Lalor SJ,etal. Inhibition of ERK MAPK suppresses IL-23-and IL-1-driven IL-17 production and attenuates autoimmune disease〔J〕. J Immunol, 2009; 183(3):1715-23.