亚硒酸钠对结直肠癌HT-29细胞AMPK/mTOR通路活化及凋亡的影响

骆 新 石劲松 卢 伟 王 忠

(新疆医科大学基础医学院药理学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011)

硒化合物具有抑制肿瘤发生的化学预防作用，血硒浓度达到113 ng/ml时具有预防癌症的效果〔1〕，血硒浓度超过120 ng/ml能有效降低癌症风险〔2〕，这些结论对结肠癌的预防有指导意义〔3,4〕。然而，关于硒化合物的抗癌机制，尤其是其促进肿瘤细胞凋亡的分子机制目前尚不清楚。激活的蛋白质激酶(AMP)在能量代谢和凋亡的调控中起到重要的作用。在细胞内AMPK被激活后可对凋亡关键调控分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平进行调控，从而促进细胞凋亡。本研究主要针对AMPK/mTOR通路在亚硒酸钠诱导结直肠癌HT-29细胞凋亡中所起的作用进行探讨。

1 材料与方法

1.1材料 结直肠癌HT-29细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。亚硒酸钠购自Sigma公司；AMPKα抗体、p-AMPK抗体和p-mTOR抗体购自Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG购自Santa Cruz公司；转染试剂购自Lonza公司；AMPK特异siRNAs购自Qiagen公司；AnnexinV/PI染色试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1HT-29细胞培养 HT-29细胞培养于含10%胎牛血清的F12培养基内，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。细胞传代至对数生长期开始实验。

1.2.2细胞处理 采用0、3、5、10和20 μmol/L的亚硒酸钠及20 μmol/L的亚硒酸钠处理HT-29细胞0、3、6、12和24 h。采用1 mmol/L的AMPKα亚基特异激活剂AICAR激活HT-29细胞中的AMPK通路。敲低HT-29细胞中AMPK表达采用的siRNAs浓度为300 pmol，有效敲低时间为72 h。

1.2.3细胞总蛋白提取 实验用细胞以冰PBS洗涤2次，400 r/min离心5 min；弃去上清，细胞沉淀中加入蛋白酶磷酸酶抑制剂和100 μl CytoBuster 蛋白提取试剂，高速涡旋细胞裂解混合物25 s，室温放置15 min；4℃，12 000 r/min 离心15 min；所得上清部分即细胞总蛋白，除留部分样品检测蛋白浓度外，其余分装15 μl/管，-80°C 冻存。

1.2.4BCA法测定蛋白浓度 按说明书倍比稀释标准品BSA；按体积比为50∶1 混合BCA 试剂A和试剂B，即为工作液；96孔板中每孔加入200 μl工作液，随后加入25 μl倍比稀释的标准品或待测样品，每种样品设置3复孔。37℃ 孵育30 min；振荡器短暂混匀后在波长562 nm 处测定OD值；根据标准品的光密度值和浓度梯度绘制标准曲线，根据标准曲线及待测样品的OD 值推算各蛋白样品浓度。

1.2.5Western印迹 等量的提取蛋白经8%～10% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶分离后，半干转印至硝酸纤维素膜上，以含5% BSA 的TBST室温封闭1 h，加入一抗4℃过夜孵育。第二天用0.1% TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入相应HRP标记二抗，室温孵育1 h。0.1%TBST 洗膜后，硝酸纤维素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。Actin为内参。所有实验至少重复3次。

1.2.6凋亡率检测 收集细胞，1 000 r/min离心5 min，1% BSA PBS洗涤1次。用100 μl Binding缓冲液将细胞重悬，加入2 μl Annexin V染料和0.1 μl PI染料，避光15 min，流式细胞仪检测。

1.3统计学分析 以SPSS15.0软件采用t检验。

2 结 果

2.1亚硒酸钠对HT-29细胞中AMPK及mTOR蛋白磷酸化水平的作用 随着亚硒酸钠浓度的升高和处理时间的延长，HT-29细胞中AMPK蛋白磷酸化水平逐渐升高，mTOR蛋白磷酸化水平逐渐降低(图1)。

2.2AICAR对mTOR磷酸化水平及HT-29细胞凋亡的影响 与对照组相比，亚硒酸钠和AICAR可显著激活HT-29细胞内的AMPK通路，抑制mTOR通路(图2A)。亚硒酸钠和AICAR处理HT-29细胞后，细胞凋亡率显著升高(图2B)。

2.3敲低AMPK蛋白表达对亚硒酸钠处理HT-29细胞中mTOR磷酸化水平及细胞凋亡的影响 与亚硒酸钠处理组相比，敲低HT-29细胞中AMPK表达后，细胞中mTOR磷酸化水平显著升高(图3A)。与单独亚硒酸钠处理组相比，敲低HT-29细胞中AMPK表达后，亚硒酸钠诱导的HT-29细胞凋亡率显著降低(图3B)。

A. 不同浓度亚硒酸钠处理HT-29细胞；B. 20 μmol/L亚硒酸钠处理HT-29细胞不同时间；Con：对照组

与对照组比较：1)P<0.01；Con:对照组，se:亚硒酸钠组，与对照组比较：1)P<0.01

与亚硒酸钠组比较：1)P<0.01；Con：对照组；se:亚硒酸钠组；si:siMAPK组：si+se:亚硒酸钠+siMAPK组

3 讨 论

近年，越来越多的证据支持硒化合物与经典的化疗或放疗方案连用不仅具有保护正常细胞的作用，并且能够达到联合化疗的作用；Husbeck等〔5〕报道亚硒酸钠能促进射线诱导的前列腺癌杀伤作用；Hu等〔6〕发现亚硒酸钠能促进TRAIL诱导的前列腺癌杀伤作用；Li等〔7,8〕报道Methulseleninic acid能通过上调Bim的表达促进Doxorubicin诱导的乳腺癌细胞杀伤作用。

AMPK是一种保守的异源三聚体蛋白质激酶，细胞内的AMPK被激活后，即刻产生急性效应，进而促进细胞内转录调节，影响细胞的生物学行为〔9〕；同时，AMPK的激活可诱导细胞自噬〔10,11〕。mTOR是一种丝/苏氨酸蛋白质激酶，可接受并整合细胞内外的各种刺激，调节细胞生长增殖、存活、自噬、凋亡等生理过程〔12〕。mTOR被认为是AMPK下游分子，AMPK通过调控mTOR磷酸化水平，进而促进细胞凋亡。

本研究发现随着亚硒酸钠浓度的升高和处理时间的延长，HT-29细胞中AMPK的磷酸化水平逐渐升高，而mTOR的磷酸化水平逐渐降低。用AMPKα亚基特异激活剂AICAR激活HT-29细胞中的AMPK通路，可显著抑制HT-29细胞中mTOR的磷酸化，这一结果与亚硒酸钠单独处理HT-29细胞结果相似，且AICAR和亚硒酸钠均可促进HT-29细胞凋亡。AICAR和亚硒酸钠作用的相似性提示亚硒酸钠可能通过激活AMPK，进而抑制mTOR，从而促进HT-29细胞凋亡。敲低HT-29细胞中AMPK表达后，以亚硒酸钠处理HT-29细胞，发现HT-29细胞中mTOR的磷酸化水平明显增加，表明AMPK为mTOR的上游分子，且AMPK对mTOR存在抑制作用。敲低HT-29细胞中AMPK表达后，亚硒酸钠处理HT-29细胞的凋亡率亦显著降低。综上所述，本研究证实亚硒酸钠可通过激活HT-29细胞中的AMPK通路，进而抑制mTOR通路的活化，从而促进HT-29细胞凋亡。

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