转化生长因子β1基因多态性与结直肠癌的关系

唐任光 韦道文 吕建生 赵 枫 黄海舸 曾冬云 黄许森 梁 亮

(右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

结直肠癌的病因和癌变机制仍不清楚，遗传因素在其中起着重要的作用。转化生长因子(TGF)-β1是细胞信号系统中的一个重要部分，它可诱导局部血管增生、胞外基质生成以及抑制免疫监视等作用，因而它在肿瘤的发生、发展中起着重要作用〔1〕。分子生物学研究表明TGF-β1基因存在着基因变异及基因多态性，这种基因多态性与乳腺癌、前列腺癌、肝癌等〔2～4〕多种疾病存在密切相关性。关于TGF-β1基因多态性与结直肠癌之间是否存在相关性，是否通过影响血清可溶性TGF-β1水平的表达而影响结直肠癌的病程等等，国内、外未见文献报道。本文采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，研究TGF-β1基因多态性及血清TGF-β1水平与广西地区结直肠癌的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取经临床病理检查确诊的结肠癌患者118例，男79例，女39例，年龄39～76岁，平均(57.6±7.7)岁。正常对照组130例，男85例，女45例，年龄32～75岁，平均年龄(55.8 ±7.2)岁，为正常体检标本。所有血液标本均取右江民族医学院附属医院的广西籍人群。

1.2研究方法

1.2.1引物设计与合成 参照文献设计引物〔5〕，由北京赛百盛有限公司合成。用于特异性扩增TGF-β1基因包含-509位点的一段DNA引物序列为正义链：5′-CAGACTCTAGAGACTGTCAG-3′；反义链：5′-GTCACCAGA GAAAGAGGAC-3′。

1.2.2基因组DNA提取 采用已建立的改良Na I法〔6〕。

1.2.3聚合酶链反应基因扩增 PCR扩增反应体系均为25 μl，其中含10×PCR Buffer 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 U，引物正义链、反义链各20 pmol，模板DNA为200 ng，TaqDNA聚合酶1.25 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至25 μl。置热循环仪(TC-48/H)中94℃预变性5 min；再按下列程序循环35次，即94℃变性40 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min；末次循环后，72℃延伸5 min。

1.2.4基因型鉴定 酶切体系包括TGF-β1基因-509C/T位点扩增产物10 μl，用限制性内切酶(英国Biolabs公司提供)Bsu36Ⅰ6 U于37℃水浴酶切3 h。TGF-β1基因-509C/T位点酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳-溴乙啶染色法检测，DNA标准物为DL-2000 Marker。电泳、染色后在紫外灯下鉴定结果，并拍照。

1.2.5血清TGF-β1水平的检测 采用酶联免疫吸附实验测定TGF-β1血清水平，试剂盒由比利时Bio Source 公司产品，具体操作步骤如下：分别加入标准品及样本各100 μl，辣根过氧化物酶结合的TGF-β150 μl ，室温孵育2 h，弃上清液，再加入显色剂(TMB) 100 μl，室温、避光孵育30 min终止反应。VIDAS型酶标仪(德国产)450 nm 处读取A值。

2 结 果

2.1TGF-β1基因型检测结果 TGF-β1基因-509C/T多态性检测共观察到CC(190 bp和229 bp)、CT(190 bp、229 bp和419 bp)和TT(419 bp)3种基因型。见图1。

1～3：TT基因型；4：CT基因型；5～7：CC基因型； M：DL2000分子量标准

2.2结直肠癌和正常对照组TGF-β1基因型和等位基因频率分布 两组TGF-β1-509C/T基因CC、CT和TT基因型分布差异显著(χ2=7.182，P<0.05)，等位基因频率在两组存在显著差异(χ2=6.877，P<0.05)，等位基因频率的相对风险分析发现，携带T等位基因的个体患食管癌的相对风险度增加1.759倍(OR=1.759，95%CI：1.150～2.691)。见表1。

表1 两组研究对象TGF-β1基因多态性分布〔n(%)〕

2.3结直肠癌组和正常对照组TGF-β1血清水平的比较 结直肠癌组与正常对照组TGF-β1血清水平差异显著〔(49.37±8.32)μg/L vs (21.38±6.25)μg/L，P<0.01〕。

2.4结直肠癌组各基因型间TGF-β1血清水平比较 TGF-β1基因-509C/T多态性CC基因型血清TGF-β1水平与TT+CT基因型之间比较差异显著(45.08±8.86)μg/L vs (51.85±8.73)μg/L，P<0.01。

3 讨 论

TGF-β1是具有多种生物学活性的细胞因子，主要通过自分泌及旁分泌发挥生物学作用，它能够抑制机体免疫反应，促进血管生成因子，细胞黏附因子生成，改变细胞生存环境，有利于增强癌细胞侵袭力及转移细胞成活，与肿瘤的生长、浸润和转移等关系密切〔7〕。TGF-β1基因位于第19号染色体长臂上，含7个外显子和6个内含子，分子生物学研究表明TGF-β1基因第1外显子存在着基因变异及基因多态性，这种基因多态性可影响TGF-β1的转录和表达，进而影响TGF-β1相关疾病的发生、发展和转归。

本研究提示T等位基因可能是结直肠癌的遗传易感基因，且血清中TGF-β1水平的升高与结直肠癌的发生与发展密切相关。出现这一结果的可能原因是，结直肠癌患者自分泌TGF-β1因子增强，高表达的TGF-β1使肿瘤细胞迅速地自主性生长而不受机体的控制，导致体内TGF-β1水平的升高。同时本研究还发现在病理条件下，携带T等位基因的个体可促进TGF-β1的高度表达而增加结直肠癌的发病风险。

综上，TGF-β1基因-509C/T多态性与结直肠癌具有相关性，其中T等位基因是结直肠癌的遗传易感基因，携带T等位基因的个体可促进TGF-β1的高度表达进而增加结直肠癌的发病风险。

4 参考文献

1Wong SF，Lai LC.The role of TGF beta in human cancers〔J〕.Pathology，2001；33(1)：85-92.

2Dunning AM，Ellis PD，McBride S,etal.A transforming growth factor beta1 signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer〔J〕.Cancer Res，2003；63(10):2610-5.

3Li Z，Habuchi T，Tsuchiya N,etal.Increased risk of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia associated with transforming growth factor-beta 1 gene polymorphism at codon10〔J〕.Carcinogenesis，2004；25(2):237-40.

4Kim YJ，Lee HS，Im JP,etal.Association of transforming growth factor-beta1 gene polymorphisms with a hepatocellular carcinoma risk in patients with chronic hepatitis B virus infection〔J〕.Exp Mol Med，2003；35(3):196-202.

5Stanczuk GA，Tswana SA，Bergstrom S,etal.Polymorphism in codons 10 and 25 of the transforming growth factor-beta 1(TGF-beta1) gene in patients with invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix〔J〕. Eur J Immunogenet，2002；29(4)：417-21.

6唐任光，韦叶生，黄照河.转化生长因子+869T/C多态性与原发性高血压的关系〔J〕.临床检验杂志，2009；27(4)：270-1.

7Fukuchi M，Masuda N，Miyazaki T,etal.Decreased Smad4 expression in the transforming growth factor-beta signaling pathway during progression of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Cancer，2002；95(4):737-43.