民族药复方美登木片微生物限度检查结果与分析

1.普洱市民族传统医药研究所,云南 普洱 665000;2.普洱市食品药品检验所,云南 普洱 665000

民族药复方美登木片微生物限度检查结果与分析

付开聪1赵琪忠2

1.普洱市民族传统医药研究所,云南 普洱 665000;2.普洱市食品药品检验所,云南 普洱 665000

微生物限度检查是用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典规定和指导研发制剂、原料、辅料微生物质量标准的依据。笔者就民族药复方美登木片研发过程中微生物限度检查验证的结果作一分析,以供同行参考。

傣族拉祜族药;复方美登木片;微生物限度检查

复方美登木片是普洱市民族传统医药研究所在挖掘整理民族民间医药过程中，筛选出来的民族药验方。源于傣族方记《档哈雅帕雅摩雅召片领景帕罕》(傣族宫庭内土司医生扎康郎香的医书——宫廷秘方集)，应用历史达500多年(此书未整理出版)。经临床观察与验证，此方具有软坚散结，消肿止痛的功效。目前，已成当地百姓及患者用于治疗乳腺小叶增生、前列腺增生及癌症化疗后的辅助用药。此药不仅疗效较好，成本低廉，而且来自于民间，起源于古代，深得百姓、患者和医生的亲睐，值得深入研究。

1 复方美登木片微生物限度检验方法步骤

1.1 阳性对照菌液的制备

1.1.1 试验菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

1.1.2 对照菌液 上述阳性菌分别接种于相应培养基中培养一定时间，取培养物用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成每1ml含菌数约为50～100cfu的阳性对照菌液备用。

1.2 细菌计数方法验证(常规法)

1.2.1 阳性对照菌液组 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌,、枯草芽孢杆菌对照液分别注入平皿(每种2个平皿)，倾注培养基培养后计数，结果见表1。

1.2.2 供试品组 取复方美登木片(批号：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供试液各1ml 分别注入平皿(每个稀释级2个平皿)倾注培养基培养后计数。结果见表1。

1.2.3 试验组(供试品加阳性对照菌液组) 取复方美登木片(批号：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供试液各1ml 分别注入平皿(每个稀释级2个平皿)分别加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌对照菌液1ml，倾注培养基培养后计数。结果见表1。

2 霉菌及酵母菌计数方法的验证(常规法)

2.1 阳性对照菌液组 取白色念珠菌液各1ml分别注入平皿(2个平皿)，倾注培养基培养后计数，结果见表1。

2.2 供试品组 取复方美登木片(批号：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供试液各1ml 分别注入平皿(每个稀释级2个平皿)倾注玫瑰红钠琼脂培养基，混匀后25℃培养72h,计数，结果见表1。

2.3 试验组(供试品加阳性对照菌液组) 取复方美登木片(批号：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供试液各1ml 分别注入平皿(每个稀释级2个平皿)分别加入白色念珠菌对照菌液1ml，倾注培养基培养后计数。结果见表1。

表1 复方美登木片细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证表(常规法)

回收率(%)=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)÷菌液组的平均菌落数(%)

3 细菌、霉菌及酵母菌计数法的验证(培养基稀释法)

通过以上对细菌、霉菌及酵母菌计数法(常规法)的验证，可看出1∶10、1∶100、1∶1000的供试液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均有抑菌作用，但通过稀释就可以降低抑菌活性，故拟先用培养基稀释法，并对该法进行方法学验证。

3.1 阳性对照菌液制备

3.1.1 试验菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

3.1.2 对照菌液 取经30～35℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7约为50～100cfu/ml备用。

取经23～28℃培养24～48h的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7约为50～100cfu/ml备用。

3.2 阳性对照菌液组 取对照菌液各1ml，分别注入平皿(5个平皿)，倾注培养基培养后计数，结果见表2。

表2-1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证表(培养基稀释法)(批号：090401)

3.2.1 供试品组 取1∶1000的供试液1ml等量分别注入5个平皿(每平皿0.2ml)，倾注肉汤琼脂培养基34℃培养48h后计数，结果见表2。

3.2.3 试验组(供试品组加阳性菌液组) 取1∶1000供试液1ml等量分别注入5个平皿(每平皿0.2ml),共3个批次，分别加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌对照菌液各1ml，倾注肉汤琼脂培养基，培养48h，计数，结果见表2。

表2-2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证表(培养基稀释法)(批号：090402)

表2-3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证表(培养基稀释法)(批号：090403)

从以上结果看出稀释法消除了本品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的抑菌作用，可采用此方法对复方美登木片进行微生物限度的细菌数检查。

3.3 控制菌检查方法的验证 取本品10g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1∶10的供试液备用。

3.4 阳性对照菌液的制备

3.4.1 实验菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

3.4.2 对照菌液 取经30～35℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7约为50～100cfu/ml备用。

表3 对照菌液计数

3.5 大肠埃希菌检查法的验证(培养基稀释法)

3.5.1 试验组 取以上1∶10的供试液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中,加入大肠埃希菌对照菌液1ml培养后取该培养物做MUG及靛基质试验。结果均为阴性，未检出大肠埃希菌。

3.5.2 阴性菌对照组 取以上1∶10的供试液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中,加入金黄色葡萄球菌对照菌液1ml培养后取该培养物做MUG及靛基质试验。结果均为阴性，未检出阴性对照菌。

3.5.3 供试品组 取以上1∶10的供试液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中培养后取该培养物做MUG及靛基质试验。结果均为阴性，未检出大肠埃希菌。

3.5.4 试验组 取以上1∶1000的供试液2ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中,加入大肠埃希菌对照菌液1ml培养后取该培养物做MUG及靛基质试验。结果均为阳性，检出大肠埃希菌。

4 结果分析与建议

在中药制剂生产过程中，原料本身是带菌者，而且生产周期长，处理繁锁，又增加了染菌的机会，中成药中含糖、淀粉、微量元素等营养成份较多，为微生物生长提供了有利条件。因此药品的染菌并非偶然，只有在取得相应的预防性措施之后，才能减少或避免污染。

生产单位及生产部门应加强对药品受微生物污染的危害性及控制药品微生物限度重要性的认识和学习，切实改善措施严格控制生产品质量；加强原料药及辅料的合理处理和灭菌，特别是含生药原粉的制剂更应加强处理，美登木生产中就有重楼以生娄入药，在投原料前应进行逐项检查验收，防止虫蛀、霉变、腐烂原料进入生产；灭菌处理应根据药物有效成份的稳定性严格控制温度及时间；重视配料容器、用具及包装材料的处理(消毒或灭菌)，已洁净的应有预防再污染的方法及措施；提高工作人员的素质，加强无菌观念，工作中严格遵守操作规程，养成良好的卫生习惯；健全质量检验机制，严格遵守检验程序，半成品检验不合格的，决不流到下一工序；成品检验不合格，决不出厂；改善仓储条件及运输条件，严防成品的再污染。

R29

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1007-8517(2014)20-0014-03

2014.09.01)