柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞增殖与凋亡的影响

董健健，程 楠，韩咏竹

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学神经病学研究所附属医院，安徽 合肥 230061)

·实验研究·

柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞增殖与凋亡的影响

董健健1，程 楠2，韩咏竹2

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学神经病学研究所附属医院，安徽 合肥 230061)

目的观察柚皮素-铜络合物在体外对人肝癌Hep-G2细胞增殖与凋亡的影响，探究其作用机制。方法将不同浓度柚皮素-铜络合物作用于体外培养的Hep-G2细胞，采用甲基噻唑基四唑法检测细胞生长抑制率；荧光显微镜下观察柚皮素-铜络合物对DAPI染色的Hep-G2细胞凋亡的影响；应用流式细胞仪检测凋亡率； Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的变化。结果柚皮素-铜络合物可显著地抑制Hep-G2细胞增殖，且在一定的范围内呈浓度依赖性。荧光显微镜下观察显示，柚皮素-铜络合物作用的Hep-G2细胞出现显著的凋亡特征，呈剂量依赖性地增加细胞凋亡率。柚皮素-铜络合物可上调Hep-G2细胞中Bax、Caspase-3蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达，且呈一定的剂量依赖性。结论柚皮素-铜络合物可抑制Hep-G2细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与上调Bax、Caspase-3蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达有关。

柚皮素-铜络合物；Hep-G2细胞；细胞凋亡；Caspase-3；Bcl-2；Bax

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上最常见且病死率最高的肿瘤之一，全球发病率逐步增加。2012年，全世界新增78万HCC患者，死亡病例多达74万[1]。中国是全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家，肝癌患者占全球的55%[2]。目前，临床上使用的化学治疗药物疗效均不理想，因此，寻找高效低毒的抗肝癌药物已迫在眉睫。Wang BD等[3]合成了柚皮素希夫碱镧(Ⅲ)配合物，并发现其具有抗肿瘤活性。Deng S等[4]发现柚皮素对人乳腺癌细胞MCF-7的活性具有抑制作用。但关于柚皮素-铜络合物的抗肿瘤活性仅有少量报道[5]。本实验采用人HCC细胞株Hep-G2细胞为研究对象，探讨柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞的抑制作用及其机制，旨在为HCC的临床治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞 人HCC Hep-G2细胞：购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药品及主要试剂 柚皮素-铜络合物：由安徽中医药大学神经病学研究所附属医院基础实验室合成；RPMI-1640培养基干粉：Gibco公司，批号 1464326；胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)：杭州四季青生物工程公司，批号 140409；胰蛋白酶：Hyclone公司，批号 30042.01；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)：Sigma公司，批号 D9542；膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ，AV)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒：贝博生物，批号 BB-4101-50T；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)：Amresco公司，批号 0793；二甲基亚砜(dimethyl suiloxide，DMSO)：Amresco公司，批号 20120210；Bcl-2、Bax和Caspase-3抗体：博奥森公司，批号分别为BA0412、BA0315、bs-0081R；β-actin抗体：Cell Signaling公司，批号 P60709；山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)：中杉金桥，批号 ZB-2301；其他试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器和设备 Olympus CKX41倒置显微镜：日本Olympus公司；96孔和6孔平底培养板：美国Corning costar公司；SPECTRA max M2e酶标仪：美国Molecular Devices公司；MCO-175 CO2培养箱：日本三洋公司；JW2502电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；LD4-8型低速离心机：北京医用离心机厂；FACS Calibur流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司。

2 方法

2.1 柚皮素-铜络合物合成 称取0.054 4 g柚皮素，溶于10 mL无水乙醇，电磁搅拌，待大部分配体溶解后，滴加NH3·H2O(NH3·H2O∶CH3CH2OH=1∶1)调节配体溶液的pH值至7～8，边搅拌边将溶有0.020 4 g CuCl2·2H2O的5 mL无水乙醇溶液滴加到配体溶液中，溶液中很快产生绿色沉淀。室温搅拌7 h，停止反应。离心分离，用无水乙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀，真空干燥后，得墨绿色固体[4]。所有配合物易溶于二甲基甲酰胺(dimethyiformamide, DMF)和DMSO，微溶于甲醇，不溶于水、丙酮、乙醚、氯仿、二氯化碳和乙酸乙酯等，在空气中性质稳定。

2.2 细胞培养 将Hep-G2细胞接种于培养瓶中，培养基为RPMI 1640(含10% FBS、青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL、2.0 g的NaHCO3)，置于37 ℃、5% CO2培养箱，相对饱和湿度的条件下培养，细胞呈单纯贴壁生长，隔日换液，待细胞长至80%～90%的密度，用胰酶/乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)消化传代，每2～3 d传代一次。

2.3 MTT法测柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞增殖的抑制作用 Hep-G2细胞以每孔3×103个接种于96孔板，用含10% FBS的RPMI 1640完全培养液培养，当细胞长至30%的融合度时，换成RPMI 1640无血清培养基培养12 h后，实验组分别加不同浓度的柚皮素-铜络合物，柚皮素-铜络合物终浓度分别为25、50、100、200、400 μmol/L，每组均设6个复孔，对照组加入完全培养基，每组均设6个复孔，在37 ℃、5% CO2中分别培养24 h后，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，继续孵育4 h，弃去培养液，加150 μL DMSO，振荡至结晶充分溶解，用酶标仪检测490 nm处光密度值(optical density, OD)，以空白对照组调零，细胞存活率=实验组OD490/空白对照组OD490×100%。实验重复3次，计算平均半数抑制浓度(concentration of inhibition 50，IC50)。

2.4 DAPI染色检测柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞凋亡的影响 取对数生长期的Hep-G2细胞以每孔105个接种于6孔板中，培养过夜，弃上清液，分别加入含不同剂量柚皮素-铜络合物药液的完全培养基2 mL，继续培养24 h，吸出培养液，每孔加入1 mL DAPI染液，室温下避光孵育10 min，弃染色液，用PBS洗3遍后于荧光显微镜下观察并拍照。

2.5 AV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡 培养24 h后收集细胞，按AV-FITC/PI凋亡试剂盒说明书操作，于1 h内上流式细胞仪用Cell Quest软件检测并分析细胞凋亡的情况。

2.6 Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的变化 取对数生长期的Hep-G2细胞接种于35 mm培养瓶中，待细胞长满瓶底80%，弃培养液，分别加入含不同剂量柚皮素-铜络合物药液的完全培养基2 mL，继续培养24 h，吸出培养液，分别加入含不同剂量柚皮素-铜络合物药液的完全培养基(50、100、200 μmol/L)5 mL，对照组加入等体积培养液，培养24 h后提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白含量。取蛋白20 μg作电泳，将蛋白样本转移至硝酸纤维素滤膜(nitrocellulose filter membrane， NC)上。滤膜用5%脱脂奶粉封闭4 h，磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffer saline with tween, PBST)洗3次，每次10 min。分别加入抗Bcl-2多克隆抗体(1∶300)，抗Bax多克隆抗体(1∶300)，抗Caspase-3多克隆抗体(1∶300)，4 ℃过夜。分别加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)，脱色摇床摇1.5 h，PBST洗3次，每次10 min。以β-actin作为内参。凝胶成像系统拍照，并扫描分析各条带的OD值，以β-actin的表达量为对照计算各组Bcl-2、Bax、Caspase-3的相对表达量。

3 结果

3.1 MTT检测柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞生长的抑制作用 柚皮素-铜络合物在25～400 μmol/L剂量下作用于Hep-G2细胞24 h，结果显示，柚皮素-铜络合物具有明显的细胞增殖抑制作用，且呈一定的量效依赖关系。柚皮素-铜络合物作用Hep-G2细胞24 h的IC50为170.23 μmol/L。见图1。

注：与0 μmol/L柚皮素-铜络合物组比较，**P<0.01。

图1 MTT法检测不同剂量柚皮素-铜络合物处理的Hep-G2细胞抑制率(n=3)

3.2 荧光显微镜观察柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞凋亡的影响 不同剂量柚皮素-铜络合物作用Hep-G2细胞24 h后，倒置荧光显微镜下可见正常细胞核荧光表达均匀，而凋亡细胞呈现核浓缩，染色加深，或核染色质呈新月形聚集于核膜一边，或核碎裂成大小不等的圆形小体，随着药物浓度的增大，这种现象更加明显。见图2。

注：A.空白对照组；B. 50 μmol/L柚皮素-铜络合物组；C. 100 μmol/L柚皮素-铜络合物组；D. 200 μmol/L柚皮素-铜络合物组；白色箭头示凋亡细胞。

图2不同剂量柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞凋亡的影响(DAPI染色，10×20倍)

3.3 柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞凋亡的影响 AV-FITC/PI双染色法检测结果显示，经柚皮素-铜络合物处理24 h后，细胞凋亡率明显增加，且呈明显量效关系。见图3。

注：A. 空白对照组；B. 50 μmol/L柚皮素-铜络合物组；C. 100 μmol/L柚皮素-铜络合物组；D. 200 μmol/L柚皮素-铜络合物组。

图3不同剂量柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞凋亡率的影响

3.4 柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响 柚皮素-铜络合物处理组与对照组比较，Bax、Caspase-3蛋白表达增加，而Bcl-2蛋白表达减少。采用Image J软件对各目的条带与内参条带进行灰度比较，并作柱状图，各组间差异具有统计学意义，Bax、Caspase-3蛋白表达水平随柚皮素-铜络合物浓度增加而升高，而Bcl-2蛋白表达水平随药物增加而降低。见图4。

4 讨论

有关金属络合物抗肿瘤活性的报道可以追溯到16世纪，但直到1960年代无机金属络合物顺铂的抗肿瘤活性被发现后，有关金属络合物抗肿瘤作用的研究逐步展开。近年来，大量研究[6-8]证实了铜络合物的抗肿瘤活性。本试验所用的柚皮素-铜络合物为新合成的物质，有研究[5]已初步证实其具有抗肿瘤活性。

细胞凋亡在肿瘤的发生发展中起重要作用[9]。本实验首先通过MTT法研究发现，25～400 μmol/L柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞具有明显的增殖抑制作用，并呈显著的量效关系。进一步采用DAPI染色发现，在一定的剂量范围内，随着柚皮素-铜络合物浓度增加，Hep-G2细胞呈现出明显的凋亡特征。随着药物浓度的增加，细胞凋亡的比率逐渐上升且呈明显的量效关系，提示诱导凋亡可能是柚皮素-铜络合物抗肿瘤作用的机制之一。

细胞凋亡的发生途径分为3种，即死亡受体依赖途径、内质网信号途径和线粒体依赖途径。Bcl-2家族是细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白。在线粒体上，Bcl-2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用，调控线粒体结构与功能的稳定性，发挥着调控细胞凋亡的作用[10-11]。Bcl-2家族包括两类蛋白：一类是抑凋亡蛋白如Bcl-2，一类是促凋亡蛋白如Bax。Bcl-2和Bax均通过调控内质网Ca2+参与的核内外物质转运及膜通透性来控制细胞色素C的释放，进而阻滞或诱导凋亡，Bcl-2/Bax比值可以决定细胞是否发生凋亡[12]。Caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起着重要的作用。在细胞凋亡信号的刺激下，Bcl-2/Bax比值缩小，使线粒体外膜通透性增高，引起细胞色素C释放到胞质中，进而活化Caspase-3启动凋亡[13]。本实验结果表明，柚皮素-铜络合物诱导细胞凋亡的作用可能与降低Bcl-2/Bax比值，启动Caspase级联反应相关。

本实验证实，柚皮素-铜络合物在一定剂量范围内有抑制Hep-G2细胞增殖的作用，其诱导细胞凋亡的机制可能与通过上调Bax、Caspase-3蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达有关，但确切机制尚需进一步研究。

注：A. 空白对照组；B. 50 μmol/L柚皮素-铜络合物组；C. 100 μmol/L柚皮素-铜络合物组；D. 200 μmol/L柚皮素-铜络合物组；与0 μmol/L柚皮素-铜络合物比较，*P<0.05，**P<0.01。

图4不同剂量柚皮素-铜络合物对Hep-G2细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响(n=3)

[1]Flores A，Marrero JA. Emerging trends in hepatocellular carcinoma: focus on diagnosis and therapeutics[J]. Clin Med Insights Oncol，2014，8：71-76.

[2] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Estimating the world cancer burden: globocan 2000 [J]. Int J Cancer, 2001, 94 (2): 153-156.

[3] Wang BD， Yang ZY， Wang Q，et al. Synthesis，characterization， cytotoxic activities，and DNA-binding properties of the La(Ⅲ) complex with Naringenin Schiff-base[J]. Bioorg Med Chem，2006，14(6)：1880-1888.

[4]Deny S, Hasnah MS，Farediah A，et al. Antioxidant and cytotoxic flavonoids from the flowers ofMelastomamalabathricumL[J]. Food Chemistry，2007，103(3)：710-716.

[5]朱金蝉.三种黄酮铜配合物的合成及其生物活性研究[D].桂林：广西师范大学，2008：20-25.

[6]Huang Q，Pan Z，Wang P，et al. Zinc(Ⅱ) and copper (Ⅱ) complexes of beta-substituted hydroxylporphyrins as tumor photosensitizers[J]. Bioorg Med Chem Lett，2006，16(11)：3030-3033.

[7]Tan SJ，Yan YK，Lee PP，et al. Copper，gold and silver compounds as potential new anti-tumor metallodrugs[J]. Future Med Chem，2010，2(10)：1591-1608.

[8]Pradeepa SM， Bhojya Naik HS， Vinay Kumar B，et al. Cobalt(Ⅱ)，Nickel(Ⅱ) and Copper(Ⅱ) complexes of a tetradentate Schiff base as photosensitizers：quantum yield of 1O2generation and its promising role in anti-tumor activity[J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2013，101：132-139.

[9]Rodriguez-Nieto S，Zhivotovsky B. Role of alterations in the apoptotic machinery in sensitivity of cancer cells to treatment[J]. Curr Pharm Des，2006，12(34)：4411-4425．

[10]Xie CY，Zhu H，Lin LP， et al. MFTZ-1， an actinomycetes subspecies derived antitumor macrolide， functions as a novel topoisomerase Ⅱpoison[J]. Mol Cancer Ther，2007，6(11)：3059-3070．

[11]谢松强，李骞，张亚宏，等.萘酰亚胺-多胺缀合物NNINspm通过PI3K/Akt信号通路诱导肝癌细胞凋亡[J].中国药理学通报，2010，26(2)：169-177．

[12]Rohrbach S，Muller-Werdan U，Werdan K，et al． Apoptosis-modulating interaction of the neuregulin/erbB pathway with anthracyclines in regulating Bcl-xS and Bcl-xL in cardiomyocytes[J]. J Mol Cell Cardiol，2005，38(3)：485-493.

[13]Yang H，Tian ST，Wu RY，et al. Glycoborinine induces apoptosis through mitochondrial pathway in HepG2 cells[J]. J Asian Nat Prod Res，2014，16(10)：991-999.

EffectsofNaringenin-CuComplexonProliferationandApoptosisofHep-G2Cells

DONGJian-jian1,CHENGNan2,HANYong-zhu2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.AffiliatedHospitalofNeurologyInstitute,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230061,China)

ObjectiveTo observe the effects of naringenin-Cu complex on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cellsinvitroand to investigate its action mechanism.MethodsHepG2 cells culturedinvitrowere treated with different concentrations of naringenin-Cu complex. MTT assay was used to determine the growth inhibition rate of HepG2 cells; the effect of naringenin-Cu complex on the apoptosis of HepG2 cells stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole was evaluated under a fluorescence microscope; the apoptosis rate of HepG2 cells was determined by flow cytometry; the expression of Bcl-2, Bax, and Caspase-3 in HepG2 cells was measured by Western blot.ResultsNaringenin-Cu complex significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-dependent manner (within a certain range of concentrations). The fluorescence microscopy showed that HepG2 cells treated with naringenin-Cu complex had marked apoptotic features, with the apoptosis rate increasing in a dose-dependent manner. Naringenin-Cu complex upregulated the expression of Bax and Caspase-3 in HepG2 cells but suppressed the expression of Bcl-2, with a certain dose dependence.ConclusionNaringenin-Cu complex can inhibit the proliferation of HepG2 cells and induce their apoptosis, possibly by upregulating the expression of Bax and Caspase-3 and suppressing the expression of Bcl-2.

naringenin-Cu complex; HepG2 cell; apoptosis; Caspase-3; Bcl-2; Bax

国家自然科学基金项目(81072738，81173212)

董健健(1989-)，女，硕士研究生

韩咏竹，hanyongzhutcm@aliyun.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.016

2014-07-10)