刘珊珊,李中南,许成群,熊园园,张 帆
(1.安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031;2. 淮北市中医医院,安徽 淮北 235000)
丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠血清TNF-α和CXCL-5的影响
刘珊珊1,李中南1,许成群2,熊园园1,张 帆1
(1.安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031;2. 淮北市中医医院,安徽 淮北 235000)
目的观察丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和趋化因子(C-X-C基序)配基5(chemokine (C-X-C motif) ligand 5,CXCL-5)表达的影响,探究其降糖作用机制。方法将健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组,模型组,吡格列酮组,丹蛭降糖胶囊高、低剂量组。采用链尿佐菌素单次腹腔注射法复制糖尿病模型,采用双抗体夹心法测定大鼠血清TNF-α、CXCL-5水平。结果与模型组比较,吡格列酮组和丹蛭降糖胶囊高、低剂量组TNF-α、CXCL-5水平显著降低(P<0.01),3个给药组TNF-α、CXCL-5比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与模型复制后0周末比较,2、4、8周末,吡格列酮组和丹蛭降糖胶囊高、低剂量组血糖水平均显著降低(P<0.01)。2、4、8周末,与模型组比较,吡格列酮组及丹蛭降糖胶囊高、低剂量组血糖水平均显著降低(P<0.01),但3个给药组之间血糖水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关分析显示,8周末血糖水平与TNF-α、CXCL-5均呈正相关(P<0.01)。结论丹蛭降糖胶囊降低糖尿病大鼠血糖的机制与其降低血清TNF-α、CXCL-5水平有关。
糖尿病;益气养阴活血法;丹蛭降糖胶囊;TNF-α;CXCL-5
随着人们生活水平的提高,糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病率呈上升趋势,既往胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)和胰岛素分泌不足被认为是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)发病机制的两个方面[1]。但近年来有研究发现,T2DM的发病机制可能是由细胞因子介导的炎性反应,是一种先天的免疫性疾病,炎症在T2DM的发病机制中起着重要的媒介作用[2]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是炎性因子的重要指标[3],趋化因子参与白细胞迁移调控,在炎症中诱导性表达,与炎症过程密切相关[4]。本研究通过检测DM模型大鼠TNF-α和趋化因子(C-X-C基序)配基5(chemokine (C-X-C motif) ligand 5,CXCL-5)的表达水平及丹蛭降糖胶囊干预后的变化,探讨丹蛭降糖胶囊的作用机制。
1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠55只,体质量(200±20)g,由安徽医科大学实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(皖)2012-2013。大鼠一般状况良好,毛发旺盛有光泽,活动正常,反应灵敏。
1.2 药物及试剂 丹蛭降糖胶囊(每粒0.35 g,由太子参、生地黄、牡丹皮、泽泻、水蛭等组成,批号 030125):由安徽中医药大学第一附属医院中药制剂中心提供;吡格列酮(每片15 mg,批号 Hz0050500):杭州中美华东制药有限公司;链脲佐菌素(streptozocin, STZ):美国Sigma公司,批号 s0130;CXCL-9试剂盒:南京建成公司,批号 E-31225;TNF-α试剂盒:上海源叶生物技术有限公司,批号 130529R。
1.3 主要仪器 RT-6000型酶标仪:雷杜有限公司;GL-88B型漩涡混合器:其林贝尔仪器制造公司;DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温箱:上海三发厂;血糖监测仪:美国强生公司。
2.1 动物模型复制 健康雄性SD大鼠55只,用基础饲料(蛋白质25%,碳水化合物60%,脂肪5%,其他10%)适应性喂养1周后,随机选出10只作为正常对照组,其余动物一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg(使用前以pH 4.4的0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制),120 h后尾静脉取血,以随机血糖≥16.7 mmol/L为模型复制成功[5]。
2.2 动物分组与给药 模型复制成功后,将DM大鼠随机分为模型组12只,吡格列酮组(10 mg/kg),丹蛭降糖胶囊高剂量组(1.08 g/kg)、低剂量组(0.54 g/kg)组各11只,均予以高脂饲料(基础饲料加猪油、麻油、鸡蛋和花生等混合而成,在1 000 g基础饲料中加入食盐150 g、白糖50 g、猪油1 000 g、麻油400 g、鸡蛋900 g。碳水化合物20%,含蛋白质30%、脂肪40%、其他10%)喂养,正常对照组以基础饲料喂养。3个药物组均按5 mL/kg灌胃给药,正常对照组和模型组均给予生理盐水5 mL/kg,每日1次,连续灌胃8周。于第2、4、8周末尾静脉采血测随机血糖,处死前一天禁食不禁水,3%水合氯醛10 mg/kg腹腔注射麻醉,迅速抽取腹主动脉血,冷冻保存。严格按照试剂盒说明书测定血清TNF-α和CXCL-5水平。实验过程中,1只大鼠未被复制成DM模型,3只大鼠因血糖过高死亡,3只大鼠因皮肤感染死亡,2只大鼠因互相打斗死亡。
3.1 各组大鼠TNF-α和CXCL-5水平比较 与正常对照组比较,模型组大鼠血清TNF-α、CXCL-5水平显著升高(P<0.01)。灌胃药物8周后,与模型组比较,丹蛭降糖胶囊高、低剂量组TNF-α、CXCL-5水平显著降低(P<0.01)。吡格列酮组与丹蛭降糖胶囊高、低剂量组TNF-α、CXCL-5水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组大鼠TNF-α和CXCL-5水平比较
注:“丹蛭”即“丹蛭降糖胶囊”之简称;与正常对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01。
3.2 丹蛭降糖胶囊对大鼠随机血糖的影响 与模型复制后0周末比较,2、4、8周末,模型组血糖水平均无显著变化(P>0.05),吡格列酮组和丹蛭降糖胶囊高、低剂量组血糖水平均显著降低(P<0.01)。模型组各时点血糖水平均显著高于正常对照组(P<0.01)。模型复制后2、4、8周末,吡格列酮组及丹蛭降糖胶囊高、低剂量组血糖水平均较模型组显著降低(P<0.01);但2、4、8周末3个给药组之间血糖水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 各组大鼠血糖水平比较
注:“丹蛭”即“丹蛭降糖胶囊”之简称;与模型复制后0周末比较,△△P<0.01;与同时点正常对照组比较,**P<0.01;与同时点模型组比较,##P<0.01。
3.3 血糖与TNF-α、CXCL-5的相关性分析 Pearson相关分析结果显示,8周末血糖水平与血清TNF-α水平呈显著正相关(r=0.815,P<0.01),与血清CXCL-5水平也呈显著正相关(r=0.777,P<0.01)。
DM是由于体内胰岛素分泌绝对或相对不足而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱,并具有遗传倾向性的疾病[6]。目前,有学者研究认为T2DM不仅是一种内分泌疾病,也是一种免疫和低度炎性疾病,炎症在T2DM的发病机制中起媒介作用,故炎性因子TNF-α、CXCL-5能够预测T2DM并发症的出现[2]。
TNF-α是一种由单核巨噬细胞等分泌的具有多种生物学效应的细胞因子,血管内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞也可合成和分泌,其可使炎性细胞聚集与黏附、微血管扩张、通透性增加,诱发炎性反应,参与肾小球损伤[7]。TNF-α还可直接作用于胰岛β细胞,造成胰岛β细胞损伤,进而诱发IR,致DM发生,也可刺激中性粒细胞产生超氧化物,引起肾脏损伤[8]。实验结果发现,模型组大鼠血清TNF-α水平明显高于正常对照组,治疗8周末,丹蛭降糖胶囊高、低剂量组TNF-α水平显著降低,提示丹蛭降糖胶囊可抑制DM模型大鼠血清TNF-α的高表达,其作用机制可能与益气养阴活血的组方成分有关。现代药理研究发现,活血药丹皮酚能下调TNF-α的高表达,减轻炎性反应[9]。水蛭能逆转凝血酶导致的内皮细胞损伤,水蛭提取液对血管内皮细胞的增殖有一定的抑制作用,从而抑制其分泌TNF-α[10]。益气药太子参能够降低TNF-α水平[11]。养阴药生地黄对甲醛致大鼠足肿胀有显著的消肿作用[12]。补肾药菟丝子黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞释放的TNF-α有明显的抑制作用[13]。由此分析,丹蛭降糖胶囊可能通过保护内皮细胞,抑制TNF-α的高表达而抑制炎性反应,保护胰岛β细胞,达到治疗DM的目的。
趋化因子是一组能够趋化细胞定向移动的小分子细胞因子,可吸引免疫细胞到达免疫应答局部,并参与免疫调节和免疫病理反应。CXCL-5是趋化因子(β型)亚家族的成员之一,可调节正常T细胞表达和分泌,是一种参与免疫调节及炎症过程的分泌蛋白[4]。CXCL-5可以激活和诱导单核细胞和巨噬细胞在胰腺郎格罕小岛的募集,诱发TNF-α的释放,在胰岛局部形成炎性反应,损伤胰岛β细胞的分泌功能。研究发现,胰腺组织表达的CXCL-5与胰岛β细胞功能呈负相关,T2DM患者外周血CXCL-5浓度增加时,应用胰岛素治疗后血清CXCL-5水平明显下降[14]。本次实验结果显示,模型组大鼠血清CXCL-5水平较正常对照组显著升高(P<0.01),丹蛭降糖胶囊高、低剂量组CXCL-5水平显著降低,提示丹蛭降糖胶囊能够明显抑制CXCL-5的高表达。研究显示丹皮酚能通过提高白细胞分化抗原4(cluster of differentiation,CD4+)T细胞数目和修复CD4+/CD8+的比值来调节T细胞亚群的数目和比例,进而改善细胞免疫应答[15]。养阴药生地黄在体内与体外实验中均能明显提高正常小鼠T淋巴细胞的增殖反应能力,显示明显的免疫调节活性[16]。太子参水煎剂有明显的刺激淋巴细胞增殖作用,能够增加小鼠免疫器官的质量,增强免疫力[11]。菟丝子可使正常雌性小鼠脾脏淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬功能增强,从而提高免疫力[12]。丹蛭降糖胶囊可能通过调节T细胞的增殖反应能力,增强大鼠免疫力,从而抑制CXCL-5的高表达。
实验结果还显示,模型复制后,模型组,丹蛭降糖胶囊高、低剂量组,吡格列酮组血糖均显著高于正常对照组(P<0.01),灌胃药物2周末,丹蛭降糖胶囊高、低剂量组血糖明显下降(P<0.01),4周、8周末血糖下降平稳,与以往实验结果一致[17]。证实丹蛭降糖胶囊降糖效果稳定。经Pearson相关分析,TNF-α、CXCL-5水平均与血糖水平呈正相关。TNF-α、CXCL-5参与DM的发生发展,丹蛭降糖胶囊在降低血糖的同时,可明显降低TNF-α及CXCL-5水平。由此推测,丹蛭降糖胶囊可能通过下调炎性因子水平,抑制炎性反应,调节免疫功能,降低血糖,达到保护内皮细胞的作用。
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EffectsofDanzhiJiangtangCapsuleonSerumLevelsofTumorNecrosisFactorAlphaandChemokine(C-X-CMotif)Ligand5inDiabeticRats
LIUShan-shan1,LIZhong-nan1,XUCheng-qun2,XIONGYuan-yuan1,ZHANGFan1
(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.HuaibeiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,AnhuiHuaibei235000,China)
ObjectiveTo observe the effects of Danzhi Jiangtang Capsule on serum levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL-5) in diabetic rats and to investigate the antidiabetic mechanism of Danzhi Jiangtang Capsule.MethodsHealthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, model group, pioglitazone group, and high- and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups. All rats except those in the normal control group were given streptozotocin by a single intraperitoneal injection to induce a diabetes model. Double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine serum levels of TNF-α and CXCL-5.ResultsCompared with the model group, the pioglitazone group and high- and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups had significantly reduced TNF-α and CXCL-5 levels (P<0.01), but TNF-α and CXCL-5 levels showed no significant differences between the three treated groups (P>0.05). Compared with those at 0 week after the model was induced, the blood glucose levels of the pioglitazone and high- and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups at the ends of the 2nd, 4th, and 8th weeks were significantly reduced (P<0.01). At the ends of the 2nd, 4th, and 8th weeks, the pioglitazone group and high- and low-dose Danzhi Jiangtang Capsule groups had significantly lower blood glucose levels than the model group (P<0.01), but blood glucose levels showed no significant differences between the three treated groups (P>0.05). Pearson correlation analysis showed that blood glucose level was positively correlated with TNF-α and CXCL-5 at the end of the 8th week (P<0.01).ConclusionFor diabetic rats, the antidiabetic mechanism of Danzhi Jiangtang Capsule involves reducing serum TNF-α and CXCL-5 levels.
diabetes; Qi-tonifying, yin-nourishing, and blood-activating therapy; Danzhi Jiangtang Capsule; tumor necrosis factor alpha; chemokine (C-X-C motif) ligand 5
国家中医临床研究基地业务建设科研专项(JDZX2012004)
刘珊珊(1990-),女,硕士研究生
李中南,lzn5151307@sohu.com
R587;R285.5
A
10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.019
2014-05-14)