羟氯喹对Toll样受体-9介导的干扰素-α表达水平的影响

张曦 金欧 黄红月 侯成成 古洁若

SLE是一种全身多脏器受累的慢性自身免疫性疾病，其主要特征为内源性核酸类物质对免疫系统的慢性激活[1］。也就是说，SLE患者循环免疫复合物中的DNA/RNA分别被Toll样受体9/7（TLR-9/7）识别后，激活相应的免疫细胞，诱导IFN-α等多种细胞因子的产生[1］。越来越多的研究发现，IFN-α的高表达在SLE的发病中起关键性作用，IFN-α与自身抗体的产生及疾病活动性相关[2］。虽然具体机制尚不清楚，但目前大多数专家认为羟氯喹可阻断TLR识别核酸类物质，从而在SLE的治疗中发挥重要作用。本研究旨在评估羟氯喹是否能够有效抑制因TLR-9激活所致的IFN-α的高表达，现报告如下。

材料与方法

一、实验材料

本研究所使用的健康志愿者的PBMC均是通过蔗糖密度梯度离心法从人外周血白膜中分离所得，分离好的外周血单个核细胞（PBMC）洗涤2次后，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基悬浮培养待用。本研究中所用到的白膜由广州血液中心免费提供。

二、主要试剂及仪器

1.主要试剂

包括：人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制剂公司），RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清（Hyclone，美国），Trizol总RNA 抽提试剂、ODN 2216（Invitrogen，美国），随机引物逆转录制备模板DNA试剂盒及荧光实时定量PCR系列试剂盒（TakaRa，日本），氯仿、异丙醇、无水乙醇（广州东征公司），焦碳酸二乙酯、羟氯喹（Sigma，美国）。

2.主要仪器

包括：SW-CJ-1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），HF151恒温培养箱（力新仪器有限公司），奥林巴斯IX51显微镜（日本），Thermo Nandrop 2000核酸蛋白分析仪（美国），ABI 2700 PCR仪、ABI 7500荧光定量PCR扩增仪（美国）。

三、方 法

1.细胞水平模拟SLE高表达IFN-α

将TLR-9配体ODN 2216（0、0.375、0.75、1.5、3.0、6.0μg/ml）与健康志愿者来源的PBMC（2×106/ml）在5%CO、37℃的恒温箱内共同培养12 h后，检测不同浓度PBMC中IFN-αmRNA表达水平。另外，使用ODN 2216 1.5μg/ml与健康志愿者来源的PBMC（2×106/ml）在5%CO、37℃的恒温箱内共同培养0、6、12、24、48 h后，检测不同时间PBMC中IFN-αmRNA表达水平。

2.不同处理组PBMC IFN-αmRNA表达水平的检测

使用ODN 2216 1.5μg/ml与健康志愿者来源的PBMC（2×106/ml）在5%CO、37℃的恒温箱内共同培养6 h后，按参考文献[3］分别加入羟氯喹1.25μg/ml（实验组）及等量的培养基（阳性对照组），在未加入ODN 2216的PBMC内加入等量的培养基（空白对照组），继续培养12 h后检测各组PBMC中IFN-αmRNA表达水平。

3.荧光实时定量PCR检测

收集各组细胞，提取各组细胞的总RNA，然后使用实时荧光定量PCR检测不同处理组PBMC中IFN-αmRNA表达水平，引物序列见表1，严格按照试剂盒说明书操作，实验所得数据按ΔΔCt法计算分析。

表1 IFN-α及β-actin的引物序列

四、统计学处理

采用SPSS13.0统计分析软件处理数据。实验数据以示，多个处理组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，两独立样本间的比较使用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞水平模拟SLE高表达IFN-α的致病状态

1.不同浓度TLR-9对PBMC中IFN-αmRNA表达水平的影响

使用不同浓度的ODN 2216与健康志愿者来源的PBMC共同培养12 h后，不同浓度组PBMC中IFN-αmRNA表达水平比较差异有统计学意义（F=12.728，P＜0.001）。其中ODN 2216浓度为1.5 μg/ml的处理组中IFN-αmRNA表达水平最高，且明显高于未予ODN 2216干预组（P＜0.001），见图1。

2.不同时间对PBMC中IFN-αmRNA表达水平的影响

使用浓度为1.5μg/ml的ODN 2216分别与健康志愿者来源的PBMC共同培养0～48 h后，不同干预时间组PBMC中IFN-αmRNA表达水平比较差异有统计学意义 （F=17.414，P＜0.001）。与1.5μg/ml的ODN 2216共同培养6 h组PBMC中IFN-αmRNA表达水平明显高于未予ODN 2216干预组（P＜0.001），见图2。

图1 不同浓度ODN 2216与PBMC共同培养12 h后IFN-αmRNA表达水平比较

图2 经1.5μg/ml ODN 2216干预不同时间后PBMC中IFN-αmRNA表达水平比较

二、不同处理组PBMC中IFN-αmRNA表达水平比较

阳性对照组PBMC中IFN-αmRNA表达水平明显高于空白对照组（t'=-5.151，P=0.002）。与阳性对照组相比，实验组PBMC中IFN-αmRNA表达水平明显降低（t'=3.34，P=0.042），见图3。

图3 不同处理组PBMC中IFN-αmRNA表达水平比较

讨 论

浆细胞样树突状细胞（pDC）在SLE发病中的起重要作用。无论是在外周血还是淋巴结中，经TLR-7/TLR-9激动剂激活的pDC均被认为是IFN-α的主要来源[4-5］。然而，多项研究发现SLE患者外周循环中pDC数量减少和（或）功能存在障碍[6］。此外，也有学者发现其他类型的细胞（如单核细胞、髓样树突状细胞、B细胞）也可以产生IFNα[5］。因此，除了pDCs外，其他类型的细胞也可能是SLE患者中IFN-α的重要来源。本研究选用包含多种类型细胞的PBMC作为研究对象，使用TLR-9激动剂 （ODN 2216）与PBMC共同培养，在体外成功模拟了SLE患者中IFN-α高表达的致病模型。

抗疟药自1894年起就已用于治疗SLE的皮肤型狼疮[7-8］。一项随机、双盲、安慰剂对照研究发现，使用羟氯喹（抗疟药）治疗的SLE患者较使用安慰剂患者，疾病复发率及严重程度明显降低[5］。早在1998年，羟氯喹已被发现能抑制CpGDNA所诱导的细胞活化[5］。基于羟氯喹的弱碱性特质，大量的研究均认为羟氯喹是通过抑制内体酸化，从而抑制内体中TLR识别核酸类物质[5］。但是，新近研究证实羟氯喹等抗疟药可直接结合TLR上的核酸结合位点，从而抑制TLR[9］。本研究发现羟氯喹可明显著抑制ODN 2216刺激后PBMC中IFN-α的高表达，结合前人的研究，推测羟氯喹可通过抑制TLR-9识别核酸类物质，从而抑制IFN-α的高表达。

综上所述，羟氯喹可明显抑制PBMC中TLR-9介导的IFN-α高表达，考虑到IFN-α在SLE的发病中起关键作用，推测羟氯喹可通过抑制TLR-9介导的IFN-α的高表达，从而有效的控制SLE的病情进展。

[1]Barrat FJ，Coffman RL.Development of TLR inhibitors for the treatment of autoimmune diseases.Immunol Rev，2008，223：271-283.

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[3]Costedoat-Chalumeau N，Amoura Z，et al.Lowbloodconcentration of hydroxychloroquine is a marker for and predictor of diseaseexacerbations in patients with systemiclupuserythematosus.Arthritis Rheum.2006，54：3284-90.

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[5]Sacre K，Criswell LA，McCune JM.Hydroxychloroquine is associated with impaired interferon-alpha and tumor necrosis factor-alpha production by plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus.Arthritis Res Ther，2012，14：R155.

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[7]James JA，Kim-Howard XR，Bruner BF，et al.Hydroxychloroquine sulfate treatment is associated with later onset of systemic lupus erythematosus.Lupus，2007，16：401-409.

[8]Costedoat-Chalumeau N，Amoura Z，Hulot JS，et al.Hydroxychloroquine in systemic lupus erythematosus.Lancet，2007，369：1257-1258.

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