山楂叶总黄酮制备工艺参数的研究

夏成凯

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230001;亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800)

李静

(亳州市食品药品检验所， 安徽 亳州 236800)

汪电雷

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230001)

山楂叶为蔷薇科植物山里红(Crataeguspinnatifida Bge.var:m a jor N.E.Br:)或山楂(Crataeguspinnatifida Bge.)的干燥叶和花[1]，具有悠久的保健和药用历史。近年来随着提取工艺、检测手段完善，在山楂叶的研究方面有了重大的进展，从山楂叶中提取出的总黄酮目前已制成益心酮片，主要用于胸闷憋气，心悸健忘，眩晕耳鸣及冠心病、心绞痛等症，同时用于抗衰老等方面[2]。山楂叶总黄酮制备工艺在《中国药典》2010版一部“益心酮片”制法中没有明确溶剂用量等工艺参数，故我们对山楂叶总黄酮的制备工艺参数进行考察确定。

1 仪器与材料

DGX-8243B型高温恒温鼓风干燥箱 (杭州汇尔仪器设备有限公司)；UV-8000S紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；R201B型旋转蒸发器(上海亚荣科技有限公司)；山楂叶(购自亳州市中药饮片厂)经亳州职业技术学院院长刘耀武副教授鉴定为蔷薇科植物山楂的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 山楂叶出粉率的考察

表1 山楂叶粗粉出粉率的考察

表2 山楂叶粗粉对溶媒吸收率的考察

取烘干后的山楂叶药材各3份，每份100g，参照《中国药典》2010版一部粉末分等，粉碎成粗粉，所有通过二号筛，但混合用四号筛不超过40%的粉，过筛，记录粗粉量。结果见表1。

2.2 山楂叶粗粉渗漉时溶媒用量的考察

2.2.1 山楂叶粗粉对溶媒吸收率的考察 取山楂叶粗粉各3份，每份100g,分别加入6、8、10倍量乙醇浸泡4h，浸泡后过滤，收集滤液。结果见表2。

从表2可知，渗漉时山楂叶粗粉对溶媒乙醇吸收率约为山楂粗粉的2倍。

2.2.2 山楂叶渗漉时收集溶媒用量的考察 由于处方中以山楂叶粗粉提取物为原料，渗漉溶剂、溶剂浓度已确定，故我们对渗漉时溶媒的用量进行考察。

表3 山楂叶渗漉时收集溶媒用量的考察

取山楂叶粗粉各4份，每份200g，待浸泡24h后，分别收集乙醇渗漉液6、8、10、12倍，按《中国药典》2010年版一部“益心酮片”项下的含量测定方法测定山楂叶黄酮的量。结果见表3。

从表3可知，当渗漉收集乙醇量为药材10倍时基本提取完全。

含量测定[3]：①对照品溶液的制备：精密称取经120℃ 干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，经超声处理使溶解，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取20ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含无水芦丁0.20mg)。②标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别至25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15min；以相应的溶液为空白。照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版 一部附录VA),在500nm的波长处测定吸光度，对照品溶液吸浓度为:8.128、16.256、24.384、35.512、40.64、48.268μg/ml时，其吸光度值分别为:0.086、0.176、0.266、0.355、0.452、0.528。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见图1。③测定法：精密量取渗漉液1ml,置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，并取同样量的供试品溶液加水至25ml作空白。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。

图1 芦丁标准曲线图

2.3 山楂叶渗漉速度的考察

在渗漉溶剂、溶剂浓度及用量已确定，我们对渗漉速度进行考察。

取山楂叶粗粉各3份，每份200g，待浸泡24h后，分别以3、5、7ml/(min·kg)的速度渗漉，收集乙醇渗漉液2000ml，测定山楂叶总黄酮的量。结果见表4。

从表4可知，渗漉速度为3ml/(min·kg)时，总黄酮量最高，但渗漉速度为5ml/(min·kg)时总黄酮量略低，从大生产的生产周期等因素综合考虑，我们认为渗漉速度宜选用5ml/(min·kg)。

表4 山楂叶粗粉渗漉速度的考察

2.4 减压回收乙醇至一定浓度的考察

取山楂叶粗粉3份，每份200g，照流浸膏剂与流浸膏项下的渗漉法[4](中国药典2000年版一部附录I O)，以乙醇为溶剂，进行渗漉，收集渗漉液10倍量，减压回收乙醇分别至0.5、1.0、1.5g生药/ml。

1)浓缩至0.5g生药/ml时，溶液中乙醇含量高，溶液体积较大。

2)浓缩至1.0g生药/ml时，溶液浓度较适宜，相对密度为1.05，60℃测。

3)浓缩至1.5g生药/ ml时，60 ℃时溶液较粘稠，不易操作。

2.5 除去色素时石油醚用量的考察

分别取6份乙醇回收液25ml ，加等量水(即25ml)稀释后，加入25、20 、15 、10 、5、4ml 的石油醚充分振摇，当第2次加入石油醚充分振摇后，分出石油醚层，加入量为5～25ml时石油醚层为无色，加入量为4ml 时石油醚层颜色较浅，除去色素时石油醚用量为5ml(即1/10量)。

2.6 醋酸乙酯提取条件的考察

2.6.1 醋酸乙酯提取次数的考察 分别取4份乙醇回收液50ml，加等量水(50ml)稀释为100 ml，加入10 ml(1/10倍)的石油醚充分振摇除去色素，分出水层，加入量为100 ml 醋酸乙酯分别振摇提取1、2、3、4次，提取液减压回收醋酸乙酯并浓缩至干，得总黄酮。按照《中国药典》2010年版一部“益心酮片”项下的含量测定方法测定山楂叶黄酮的含量。结果见表5。

表5 醋酸乙酯提取次数的考察

表6 醋酸乙酯的每次用量的考察

从表5可知，醋酸乙酯提取3次时基本提取完全。

2.6.2 醋酸乙酯的每次用量的考察 分别取4份乙醇回收液50ml，加等体积水(50ml )稀释后为100ml ，加入10ml (1/10倍)的石油醚充分振摇除去色素，分出水层，分别加入90、80、70、60ml 醋酸乙酯分别振摇提取3次，提取液减压回收醋酸乙酯并浓缩至干，得总黄酮，按照《中国药典》2010年版一部“益心酮片”项下的含量测定方法测定山楂叶总黄酮的量。结果见表6。

从表6可知，70ml醋酸乙酯提取3次基本提取完全。

2.7 验证试验

分别取山楂叶粗粉各3份，每份200g，照流浸膏与浸膏剂项下的渗漉法(中国药典2010年版一部附录IO)，以乙醇为溶剂，进行渗漉，收集渗漉液10倍量，减压回收至一定浓度(相对密度为1.05，60℃测)，加等体积水稀释后，加入1/10倍量体积的石油醚除去色素，分出水层，用醋酸乙酯振摇提取3次，醋酸乙酯的每次用量为0.7倍，提取液减压回收醋酸乙酯并浓缩至干，得总黄酮。按照《中国药典》2010年版一部“益心酮片”项下的含量测定方法测定山楂叶黄酮的量。结果见表7。

表7 三批验证试验

3 结论

综合山楂叶的渗漉试验和醋酸乙酯的提取试验结果，山楂叶总黄酮的最佳工艺条件为：取山楂叶，粉碎成粗粉，照流浸膏与浸膏剂项下的渗漉法(中国药典2010年版一部附录I O)，以乙醇为溶剂，进行渗漉，收集渗漉液10倍量，减压回收乙醇至一定浓度(相对密度为1.05，60℃测)，加等体积的水稀释后，加入1/10倍量体积的石油醚除去色素，分出水层，用醋酸乙酯振摇提取3次，醋酸乙酯的每次用量为0.7倍，提取液减压回收醋酸乙酯并浓缩至干，得总黄酮。

一般情况下山楂叶提取的方法有以下几种：水煎煮法，该法提取物粗糙，总黄酮含量低；溶剂萃取法，该法提取物质量好，但成本较高，不适宜大批量生产；乙醇渗漉，石油醚除去杂质，醋酸乙酯萃取法，该法提取利用溶剂较少，杂质也较少，但时间较长。综上我们认为第三种方法较好。

在渗漉过程中，浸泡时间越长，渗漉越完全，提取物含量越高。同时我们要综合考虑到影响渗漉的因素，其中包括药材的粒度，溶媒的浓度、用量，渗漉速度等，在溶媒浓度已确定的情况下，我们重点考察的是渗漉的速度及溶媒用量。

在用醋酸乙酯萃取的过程中，醋酸乙酯用量较小的时候，不能够达到分离的目的，在不断添加醋酸乙酯并充分振摇后，醋酸乙酯用量为乙醇浓缩液加等量水后的0.7倍时完全分离。

[参考文献]

[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：

[2] 于栋华，包顺茹,于纯淼,等.山楂叶总黄酮药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2013，15(3):174-176.

[3] 张文莉，高敏，石森林 .山楂叶总黄酮的提取及鉴别[J].中华中国医药学刊，2011，30(7)：578.

[4] 张慧.合欢花总黄酮的分离纯化工艺[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(18)：27-29.