PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中突变的研究

袁鹏飞，汪建光，张丽柯，靳高远，刘德纯

PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中突变的研究

袁鹏飞，汪建光，张丽柯，靳高远，刘德纯

目的探讨PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中突变的关系。方法选取200例乳腺癌患者组织标本，其中luminal A、luminal B、HER-2过表达型、besal-like型各50例。提取DNA，用紫外光分光光度仪来测定浓度及含量， 对exon9及exon20进行PCR扩增 ，扩增产物纯化后测序，另取20例乳腺腺病组织标本用作为对照，与基因库序列对比分析其突变的情况。结果200例乳腺癌组织中发现突变64例，突变率32%，其中exon9突变26例(40%)，exon20突变38例(60%)，在乳腺癌分子亚型中：luminal A型中22例(44%)，luminal B型中16例(32%)，HER-2过表达型 20例(40%)，besal-like型6例(12%)，突变分布有统计学意义(P<0.05)。在20例良性对照组中均没发现突变。PIK3CA基因突变与乳腺癌肿瘤患者肿瘤大小、年龄、淋巴结状态之间无明显相关性(P>0.05)。结论PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中的突变有差异，与乳腺癌其他临床病理特征之间无明显相关性。

PIK3CA基因；突变；乳腺肿瘤

乳腺癌(breast cancer)是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤，其发病率逐年上升，目前已成女性发病第一的恶性肿瘤[1]。乳腺癌的发生和发展中癌基因激活和抑癌基因失活导致细胞异常增殖是该过程的重要分子机制之一。

磷脂酰肌醇-3-激酶催化单位α(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic alpha,PIK3CA)PIK3CA基因突变通过PIK3/AKT信号通路与乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌和骨髓异常增生综合征等多种肿瘤的发生相关[2，3]。本研究通过对乳腺癌组织中的PIK3CA基因外显子9和外显子20两个突变区检测,探讨PIK3CA基因突变和乳腺癌临床病理特征的联系及预后的关系。

1 材料与方法

1.1材料从2012年至2013年河南科技大学第一附属医院乳腺外科收集的原发性乳腺癌组织中挑选200例，其中luminal A型、luminal B型、HER-2过表达型、besal-like型各50例，标本均在切除后30 min内放入液氮中，并存在-80℃超低温冰箱中，年龄35～66岁，平均(50.5±10.20)岁，所有病例均经病理科确诊均为浸润性导管癌并用免疫组织化学方法分型。另收集同期科内乳腺腺病20例标本对照。

1.2DNA提取组织DNA抽取采用QIA GEN组织DNA抽提试剂盒，参照说明书标准步骤进行抽提。

1.3PCR扩增PIK3CA基因第9及20外显子引物用Primer Premier 5.0软件设计，由上海英俊有限公司合成。PCR反应体系：2×Goldstar 10μL,灭菌蒸馏水6 μL，模版DNA 2 μL，引物2 μL，加样体系20 μL。PCR反应条件：95℃预变性10 min，然后95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，进行35个循环，最后72℃延伸10 min。

1.4电泳PCR产物放置于Tanon power EPS 300 电泳仪110 V电压，电流80 mA，电泳20 min。

1.5DNA测序PCR产物纯化后在ABI 3730XL DNA测序仪上进行，由上海宝藤医学检验所完成。

1.6统计学方法分析PIK3CA基因突变的状态与患者年龄关系用t检验，采用χ2检验分析PIK3CA基因突变与乳腺癌临床病理特点的关系，统计处理均采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PIK3CA基因突变区域检测结果PIK3CA基因的突变：200例乳腺癌组织中，PIK3CA基因突变64例(32%)，其中exon9突变26例(40%)，exon20突变38例(60%)，所有突变均为错义突变。PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中的突变见表1。

2.2PIK3CA基因突变与患者临床病理特征的关系PIK3CA基因突变与患者的年龄、淋巴结转移、肿瘤大小、分化程度及p53表达等无统计学相关性(P>0.05)。

表1 PIK3CA基因在乳腺癌不同分子亚型中的突变

注：PIK3CA基因在不同分子亚型中的突变有统计学意义(χ2=13.971,P<0.05)。

3 讨论

PIK3CA基因是位于染色体3q26.3上的一段34 kb的基因，染色体由编码1 068个氨基酸的20个外显子组成，该组氨基酸产生一组长度为124 KD的蛋白构成了ⅠA类PIK(磷酸肌醇3-激酶)的催化亚单位P110a，其主要功能是催化4，5-PIP2成为3，4，4-PIP3，而PIP3可作为第二信使结合并且激活多种细胞内靶蛋白。2004年发现PIK3CA基因在多种肿瘤中存在突变[4]，PIK3CA基因突变通过PI3K/AKT的途径引发AKT持续活化，导致成纤维细胞和乳腺上皮细胞的生长和转化，抑制细胞凋亡，与乳腺癌发生、发展的关系密切[5]。

研究表明，PIK3CA基因突变80%-90%聚集在该基因的第9外显子和第20外显子，分别对应该酶的螺旋区和激酶区[6]。乳腺癌组织中PIK3CA基因突变频率在8%～40%。研究证实PI3K通路的激活，无论是通过抑癌基因PTEN的失活还是癌基因PIK3CA的激活，都可引起乳腺癌患者对靶向药物Herceptin的耐药[7-8]。

本研究中luminal A型中22例(44%)，luminal B型中16例(32%)，Her-2过表达中20例(40%)，besal-like型中6例(12%)，在乳腺癌不同分子亚型中突变发生率不同，而在20例良性对照组中均没发现突变。PIK3CA基因突变和ER表达相关[9-10]。Akt依赖性ER激活，提示ER阳性肿瘤选择性生长[11]。然而，对内分泌治疗抵抗的PIK3CA基因突变乳腺癌患者，或许是PI3K抑制剂的敏感人群。本研究的结果证实了PIK3CA基因在乳腺癌组织中的存在突变，在乳腺癌不同分子亚型中有突变的差异，PIK3CA基因突变与乳腺癌临床病理特征之间关系有待进一步研究。

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StudyofPIK3CAGeneMutationinDifferentMolecularSubtypesofBreastCancer

YUAN Peng-fei,WANG Jian-guang,ZHANG Li-ke,et al

(First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo investigate correlation ofPIK3CAgene mutation in different molecular subtypes of breast cancer.MethodsTo select 200 cases of breast cancer tissue samples,The luminal subtype A,luminal subtype B,HER-2 over-expression subtype and besal-like subtype all the 50 cases.To extract DNA from samples of breast cancer,PCR amplification of exons 9 and 20 was done after determining the concentration and content by ultraviolet spectrophotometer,followed by sequence after the product was purified.Another 20 samples of adenosis of breast were chosen as controls.ResultsThe frequency ofPIK3CAmutations among 200 cases was 64 missense mutations (32%),26(40%) in exon 9,38(60%) in exon 20 were found.In molecular subtype of breast cancer:22(44%) in luminal subtype A ,16(32%) in luminal subtype B,20(40%) in HER-2 over-expression subtype,6(12%) in besal-like subtype,mutations distribution had statistical significance(P<0.05).No mutation was found in 20 cases of adenosis of breast.The mutation ofPIK3CAgene had no significant correlation with age,tumor size and lymph node status(P>0.05).ConclusionThe mutations ofPIK3CAgene with different molecular subtypes are different in breast cancer.However,there is no significant correlation betweenPIK3CAgene mutations and the pathological features of breast carcinoma.

PIK3CAgene；mutation；breast neoplasms

2014-08-21

河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003

袁鹏飞(1987-)，男，河南洛阳人，硕士，从事肿瘤的基础研究与临床治疗工作。

刘德纯，男，教授，E-mail：liudechun2008@126.com

R737.9

A

1672-688X(2014)04-00245-03