基于超声波辅助法的杜仲籽蛋白提取工艺优化*

黄 诚，尹 红

(吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000)

基于超声波辅助法的杜仲籽蛋白提取工艺优化*

黄 诚，尹 红

(吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000)

采用单因素和正交试验方法对超声波辅助提取杜仲籽蛋白工艺进行了优化.先选取料液比、超声时间、超声温度、浸提pH值等条件对杜仲籽蛋白的提取工艺进行单因素实验，采用L9(34)正交试验确定本工艺最佳条件.实验结果表明，在超声波辅助提取杜仲籽蛋白最佳工艺条件(料液比为1∶25，超声时间为30 min，超声温度为50 ℃，浸提pH值为10.0)下，杜仲籽蛋白提取率为77.03%.

杜仲籽蛋白；超声波辅助提取；正交试验

杜仲(EucommiaulmoiclesOliv)树高可达15～20 m[1]，是中国地质史上第三纪冰川运动残留下来的古生物树种[2]，是中国特有的单科单属植物，为中国特有的优良经济林树种[3].杜仲主要分布在中国的湖南、湖北、陕西、四川、重庆、贵州等西部省市[4]，而湘西武陵山区野生杜仲资源丰富，且建有规模化的杜仲商品生产基地[5]，湖南西部地区曾有杜仲8/3×104hm2，现成片仍有4/3×104多hm2.研究表明：杜仲皮蛋白具有较强抗菌作用[6-8]，杜仲籽中亦富含蛋白质，而蛋白质在细胞的结构和生理功能中起着重要的作用，是人体生命活动不可缺少的物质基础；血红蛋白可以携氧，肌纤蛋白能够收缩，糖蛋白具有识别功能，抗体的免疫、载体的运输、酶的催化、激素的调节都需要蛋白质；杜仲籽中蛋白质的开发具有较高利用价值.

目前蛋白的提取有很多方法，如酶法、碱提酸沉法、微波法等[9].蛋白质提取涉及到物理、化学、生物等方面知识，但基本原理不外乎2个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的2个或几个物相中；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于同区域而达到分离目的.本文采用通过物理力场超声波技术提取方法，免去了高温对提取成分的影响的独特优势，目前广泛运用于天然植物有效成分提取[10-13].本实验以杜仲籽为原料，采用超声波法辅助提取杜仲籽粕蛋白，通过正交试验确定最佳工艺参数，以便为杜仲籽粕中蛋白质的开发提取提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1仪器与设备

KDN-2C型定氮仪(上海纤检仪器有限公司)；HYP-Ⅱ型消化炉(上海精隆科学仪器有限公司)；FW200型微型粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；索氏抽提装置；SB-3200YDTD超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；LXJ-IIB飞鸽牌离心机(上海安亭科学仪器厂)；雷磁PHS-J4A型实验室pH计(上海精密科学仪器有限公司)；723可见分光光度计(上海菁华科技有限公司)；温度计；HH-2恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；BGZ-146干燥箱(上海博迅实业有限公司)；FA2004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司).

1.2材料与试剂

杜仲籽(购自湘西吉首)，石油醚(60～90 ℃沸程)，无水碳酸钠，邻苯二甲酸氢钾，磷酸，无水乙醇，小牛血清蛋白(生化试剂)，浓盐酸，浓硫酸，无水硫酸铜，硼酸，氢氧化钠，硫酸钾，所有试剂均为分析纯试剂.

1.3实验方法

1.3.1 工艺流程 杜仲籽→去壳→干燥→粉碎→除去油脂→凯氏定氮法测杜仲籽粕中蛋白质含量→超声波提取→离心分离→喷雾干燥→产品.称取一定量脱脂杜仲籽粉，加入适量的水浸泡,用20%氢氧化钠溶液调至浸泡液pH值到10,电动搅拌,用高速离心机分离，所得清液用1∶1盐酸调至蛋白等电点.离心后，采用喷雾干燥法，制得产品.

1.3.2 原料预处理 杜仲籽去壳放入干燥箱中干燥后粉碎，用索氏抽提装置去除杜仲籽中的油脂，低温烘干，待用.

1.3.3 单因素试验 (1)料液比对杜仲籽粕蛋白提取率的影响.固定pH值为10.0，提取时间为40 min，温度为40 ℃，分别设定料液比为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，研究料液比提取杜仲籽粕蛋白的最佳值.(2)时间对杜仲籽粕蛋白提取率的影响.固定pH值为10.0，温度为4 0℃，料液比为1∶30，分别设定超声时间为10，15，20，25，30，35 min，研究提取杜仲籽粕蛋白提最佳时间.(3)温度对杜仲籽粕蛋白提取率的影响.固定pH值为10.0，提取时间为30 min，料液比为1∶30，分别设定超声温度为25，30，35，40，45，50 ℃，研究提取杜仲籽粕蛋白提最佳温度.(4)浸提pH值对杜仲籽粕蛋白提取率的影响.固定超声温度50 ℃，料液比1∶30，超声时间30 min，分别设定pH值为8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0，研究提取杜仲籽粕蛋白最佳pH值.

1.3.4 正交试验 选用提取时间、料液比、浸提液pH值及提取温度对本工艺进行正交实验，确定最佳工艺参数，正交实验中，采用蛋白质提取率作为本工艺条件评价指标，用L9(34)正交试验进行选择(见表1)[14].

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 杜仲籽粕蛋白等电点测定 取20 g脱脂油粕粉碎之后，加200 mL水浸泡,用质量分数为10%氢氧化钠调至pH值至10,搅拌,离心得到上清液.分别取上清液20 mL，加盐酸调pH至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，静止4～5 h，离心分离，然后测定沉淀前后上清液中蛋白质含量，蛋白质沉淀率最高者所对应的pH值为沉淀蛋白质的最佳等电点.

1.3.6 蛋白质含量测定方法 蛋白质含量测定采用 凯氏定氮法GB5511-85.

1.3.7.样品测定 (1)将离心后的杜仲籽粕蛋白溶液定容到100 mL，准确移取溶液10 mL，采用凯氏定氮法，计算出蛋白质含量.(2)蛋白质提取率的计算公式：

2 结果与分析

2.1蛋白质含量的测定

采用微量凯氏定氮法对杜仲籽粕中蛋白质含量进行3次平行测定[15]，测得杜仲籽粕中蛋白质质量分数为19.49%.

2.2超声波辅助提取杜仲籽粕蛋白的单因素试验

图1 料液比对蛋白提取率的影响

(1) 料液比对蛋白提取率的影响.料液比对杜仲籽粕蛋白质提取率的影响结果如图1所示.

图2 不同超声时间对蛋白提取率的影响

由图1可知，由于杜仲籽粕中含有一定量的膳食纤维，当料液比较小时，其中的膳食纤维具有较强的吸水膨胀能力，使物料流动性差，难以搅拌，蛋白质提取率低.当料液比增加到1∶20时，料液比增大时，超声波的渗透作用增强，可直接作用内部组织，故提取率增高；继续增加料液比发现在料液比为1∶30时，提取率达到最大值；再继续增加料液比，提取率反而会下降，这可能是因为料液比过大，可能造成其他物质更多地溶解出来，阻碍杜仲籽粕中蛋白质溶解.因此，本工艺提取杜仲籽粕蛋白的最佳料液比为1∶30.

(2) 超声时间对杜仲籽粕蛋白提取率的影响.不同超声时间下杜仲籽粕的蛋白提取率，结果如图2所示.

由图2可知，试验开始时随着浸提时间增加蛋白质提取率升高.在30 min时提取率最大，随着时间的进一步增加，蛋白质的提取率不升反降.这是由于超声波的渗透作用，使得溶出物增多，阻碍杜仲籽粕中蛋白质溶解，所以本工艺提取杜仲籽粕蛋白的最佳超声时间为30 min.

图3 不同超声温度对蛋白提取率的影响

(3) 超声温度对杜仲籽粕蛋白提取率的影响.不同超声温度下杜仲籽粕蛋白的提取率，结果如图3所示.

由图3可知，温度高低对杜仲籽粕蛋白质溶解度有较大影响，随着温度升高，蛋白质提取率增大.但由于蛋白质在50～60 ℃易受热变性，维持蛋白质空间构象的次级键被破坏，引起天然构象的解体，原来在分子内部的一些疏水基团被暴露到分子表面，导致蛋白质分子间的相互结合而凝结沉淀，使蛋白质提取率下降[17-18].蛋白质变性影响产品的功能性，而且黏度增大，分离困难，浸提能耗也增加，故本工艺提取杜仲籽粕蛋白的最佳超声温度为50 ℃.

图4 不同浸提pH值对杜仲籽粕蛋白提取率的影响

(4) 浸提pH值对杜仲籽粕蛋白提取率的影响.不同浸提pH值下杜仲籽粕蛋白的提取率，结果如图4所示.

由图4可知，在pH为8.5～10范围下，蛋白质提取率随着pH值得增大而逐渐增加，在pH为10.0的时候蛋白质的提取率达到最大值，pH值在10.0以后随着pH值的增大蛋白质的提取率反而降低.pH值太高，提取液会较粘稠，呈深褐色，在酸沉时会消耗大量的酸，导致产品中盐分增加，不利于后续分离工序的进行，碱性太强还可引起脱氨、脱羧、肽键断裂，引起胱赖反应，将氨基酸转变为有毒化合物.因此，综合上述因素考虑，本工艺提取桐粕蛋白质适宜pH值为10.0.

(5) 杜仲籽粕蛋白等电点的确定.加酸至等电点沉淀蛋白质是从提取液中分离蛋白的有效方法，它可以使提取液中蛋白最大程度地沉淀.故等电点的选择是本工艺的关键工序.按上述等电点确定方法实验，结果表明，当提取液pH值为4时，蛋白质沉淀率最高，为69.7%；当pH值为4.5时，蛋白质沉淀率为69.2%,两者相差甚微，由此可知，最佳沉淀pH值为4.0～4.5之间.进一步试验筛选，选取其中间值4.2试验，蛋白沉淀率为70.2%，高于两端点pH值蛋白沉淀率.故本工艺选取pH值为4.2为酸沉最佳pH值，即为蛋白质沉淀最佳等电点.

2.3正交试验及结果分析

以杜仲籽粕蛋白提取率为指标进行试验，对正交试验的结果进行了分析，结果见表2.

表2 正交试验方案与结果计算表

极差的大小表明因素对指标的影响程度.极差大，因素对指标的影响大，该因素为重要因素；极差小，因素对指标的影响小，该因素为不重要因素，依据极差大小，影响提取的主要因素为超声时间和pH值，料液比和超声温度对蛋白质提取率的影响稍小一些，影响杜仲籽粕蛋白提取率的主要因素主次顺序为：B>D>A>C，最佳工艺为A1B2C2D2.最优提取条件：料液比1∶25，超声时间30 min，超声温度50 ℃，pH值10.0.在此工艺条件下，杜仲籽粕蛋白的提取率为77.03%.

3 结语

(1) 研究了影响杜仲籽粕蛋白提取率的料液比、超声时间、超声温度、浸提pH值等因素的提取条件.结果表明：影响杜仲籽粕蛋白提取的主要因素是超声波提取时间，其次是pH值，超声温度、料液比对杜仲籽粕蛋白提取率影响较小.

(2) 等电点法是提取植物蛋白的常用方法.由实验可知：桐粕桐粕蛋白沉淀的等电点为pH值为4.3，该等电点沉淀杜仲籽粕蛋白，其沉淀率可达70.2%.采用正交实验优化工艺参数，以蛋白提取率为指标，确定该工艺最佳参数为：料液比为1∶25、pH 值为10.0、超声时间为30 min、超声温度为50 ℃.在此条件下杜仲籽粕蛋白的提取率达77.03%.

(3) 充分开发和利用这些杜仲籽粕资源，不但可解决湘西地区蛋白饲料不足的问题，而且还能够改善环境,变废为宝.同时对于开发利用山区资源及杜仲种植、加工业,饲料工业和养殖业的发展将带来极大的促进作用.

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(责任编辑 易必武)

TechnicalConditionsforUltrasound-AssistedExtractionofProteinofEucommiaSeed

HUANG Cheng，YIN Hong

(Food Science Institute,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

The optimum conditions for the ultrasound-assisted extraction of Eucommia seed protein were studied by single factor and orthogonal test method.The solid-liquid ratio,ultrasonic time,ultrasonic temperature,extraction pH value were selected as single factor to study experimental conditions of Eucommia seed protein extraction process,and then optimum process conditions were determined by L9(34) orthogonal test.The experimental results showed that the optimum conditions for ultrasound-assisted extraction of Eucommia seed proteins were as follows:solid to liquid ratio was 1∶25,ultrasonic time 30 min,ultrasonic temperature at 50 ℃,extraction pH value of 10.0.Under this condition,extraction rate of Eucommia seed protein was 77.03%.

protein of eucommia seed；ultrasound-assisted extraction；orthogonal test

1007-2985(2013)06-0078-05

2013-09-03

湖南省科技厅计划项目(2012J3099)

黄 诚(1963-)，男，湖南洞口人，吉首大学食品科学研究所教授，硕士，主要从事天然产物的开发及利用研究.

TS224.4；TQ351

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2013.06.018