E-cadherin、Snail、Twist在胃癌组织及淋巴结转移灶中的表达及临床意义

刘利敏，李继坤

(上海交通大学附属第一人民医院 普外科，上海，200080)

胃癌是目前中国第4位常见恶性肿瘤，新确诊的恶性肿瘤病例中8%为胃恶性肿瘤[1]。上皮间质转化(EMT)参与胚胎发育、组织重建和肿瘤转移，本研究通过检测胃癌原发灶和淋巴结转移灶中参与EMT的有关蛋白E-cadherin、Snail及Twist的表达，分析及其与临床病理特征、预后情况等的相关性，探讨EMT与淋巴结转移之间的关系及其在胃癌侵袭和转移中的作用和临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2005年12月—2010年7月在上海市第一人民医院普外科行标准胃癌根治术(D2)的80例患者为研究对象。其中男62例，女18例；确诊时年龄45～83岁，中位年龄63岁；Lauren分型：肠型48例，弥漫型32例。所有患者术前各项检查及术中未发现远处转移，术前未行新辅助放、化疗。

1.2 方法

1.2.1 标本收集：选取胃癌原发癌灶组织、癌旁正常胃黏膜组织(距肿瘤切缘5cm以上)、胃癌转移淋巴结及正常淋巴结。

1.2.2 检测方法：所有标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，3 μm切片，常规脱蜡及水化，进行免疫组化染色，方法选用EnVision法。之后的操作按SP试剂盒说明书进行，DAB显色，一抗(鼠抗人单克隆抗体E-cadherin(M0536)、山羊抗人Snail(ab53519)多克隆抗体、兔抗人Twist(ab50581)多克隆抗体皆购自英国Abcam公司)工作浓度为：E-cadherin(1∶100)，Snail(1∶200)，Twist(1∶200)。PBS代替一抗作为空白对照；以已知阳性切片作为阳性对照。

1.3 观察指标

观察患者胃癌术后生存情况；观察E-cadherin、Snail和Twist蛋白在胃癌组织、淋巴结转移灶及癌旁正常黏膜组织中的表达情况；分析胃癌组织及淋巴结转移癌组织中E-cadherin、Snail、Twist蛋白表达与临床病理学特征的关系。

1.4 评价标准

用双盲法对染色结果进行评估。E-cadherin表达于胞膜或胞质，呈黄色染色为阳性细胞，Twist蛋白表达于细胞质，少数位于胞核，呈清晰的棕色或棕褐色为阳性细胞。每例切片随机选取10个高倍视野，以阳性细胞的百分比进行结果判定。E-cadherin：阳性细胞百分比≥25%为阳性；Twist：阳性细胞百分比≥5%为阳性。

Snail染色以胞核或/和胞浆出现淡黄色至棕黄色为阳性细胞。细胞按染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分作半定量分析。染色强度以多数细胞呈现的染色特性计分，与背景着色相对比，0分：无染色；1分：弱阳性；2分：阳性；3分：强阳性。按着色细胞百分比，1分：1%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%。然后按阳性细胞×染色强弱计积分，积分1～2为阴性，积分3～12为阳性。

2 结 果

2.1 E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表达

E-cadherin表达主要位于胞膜或胞浆内，在癌旁正常胃黏膜组织中阳性表达率为100%(80/80)，原发灶中为37.50%(30/80)，淋巴结转移组织中为63.75%(51/80)；Snail主要在细胞胞浆内或胞核表达，在正常胃黏膜组织内阳性表达率为30.00%(24/80)，胃癌组织中为71.25%(57/80)，淋巴结转移灶中为53.75%(43/80)；Twist蛋白表达于细胞质，少数位于胞核，呈清晰的棕色或棕褐色，在正常胃黏膜组织中阳性表达率为10.00%(8/80)，胃癌组织中为73.75%(59/80)，淋巴结转移灶中为68.75%(55/80)。

胃癌原发灶与癌旁正常胃黏膜组织中三种蛋白的阳性表达率均有显著差异(P<0.01)；胃癌原发灶及淋巴结转移灶中E-cadherin蛋白和Snail蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)，而Twist蛋白的表达无显著差异(P>0.05)。

2.2 胃癌原发灶中E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表达与临床病理学指标的关系

胃癌原发灶中E-cadherin的表达下调、Snail的过度表达与组织学类型、浸润深度、淋巴结转移及pTNM分期有关(P<0.05)，Twist过度表达与组织学类型、浸润深度无关(P>0.05)，三种蛋白的表达均与性别、年龄、肿瘤部位无关(P>0.05)，见表1。

2.3 E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表达对胃癌术后生存情况的影响

E-cadherin表达的患者预后显著好于不表达的患者(图1)，而Snail、Twist阳性表达的患者与阴性患者相比，预后较差、生存率较低(图2、图3)。

总体生存率的多因素分析显示，E-cadherin的表达情况、组织学分类、有无淋巴结转移为影响胃癌患者预后的独立因素(P=0.018，P=0.012，P=0.025)，见表2。

表1 胃癌组织中E-cadherin、Snail、Twist蛋白表达与临床病理学特征的关系[n(%)]

表2 总体生存率的多因素分析

图1 E-cadherin阳性/阴性患者生存曲线

图2 Snail阳性/阴性患者生存曲线

图3 Twist阳性/阴性患者生存曲线

3 讨 论

近年来，随着诊断技术的提高和内镜的推广，胃癌的早期诊断率逐步提高，但标准胃癌根治手术(D2)仍然是目前唯一有望治愈胃癌的方法。研究表明，淋巴结转移情况是影响胃癌患者预后的最重要的因素之一[2]，即使是早期胃癌，如果伴有淋巴结转移，与无淋巴结转移患者相比更容易复发，预后更差[3]。但是目前作者对淋巴结转移灶在肿瘤侵袭转移过程中的作用机制还不明确。

上皮间质转换(EMT)是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转分化的现象，其参与胚胎发育、组织重建和肿瘤转移，上皮细胞表型的缺失及间质特性的获得是其主要特征。E-cadherin蛋白是上皮表型的重要标志，E-cadherin蛋白功能丧失被认为是EMT发生的一个重要标志，多种肿瘤的侵袭转移均与E-cadherin表达减弱有关[4]。

研究显示[5]，在胃癌原发灶组织及淋巴结转移癌组织中E-cadherin蛋白的表达较正常胃黏膜组织中明显降低。另有学者发现胰腺癌中EMT相关蛋白E-cadherin的低表达可能会促进淋巴结转移[6-7]。E-cadherin蛋白的表达与肿瘤浸润深度呈负相关，存在浸润越深，病理分期越晚，E-cadherin蛋白阳性表达则相应下降，提示在胃癌发生发展过程中出现了上皮细胞表型的缺失，且这种缺失与肿瘤的侵袭能力相一致。此外，研究结果显示伴有淋巴结转移的患者，E-cadherin蛋白的表达明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明E-cadherin的缺失对于胃癌的浸润和转移具有重要意义。多因素分析也表明E-cadherin的表达情况、组织学分类、有无淋巴结转移为影响胃癌患者预后的独立因素(P=0.018，P=0.012，P=0.025)，与本研究结果一致。

Snail、Twist均为EMT发生过程的转录调节因子。有研究表明在胃癌原发灶与淋巴结转移灶中Snail、Twist蛋白的转换较为频繁，这可能是因为由EMT产生的肿瘤细胞在淋巴结转移灶中能够更频繁的筛选出具侵袭性的细胞群[8]，提示可能根据这几种蛋白的表达情况，来判断胃癌原发灶的侵袭性和转移性。Shin等[9-10]发现胃癌患者EMT相关蛋白Snail的过度表达与淋巴结转移密切相关，并提示预后不良。Markiewicz等[11-13]在乳腺癌中以EMT相关标志物判断肿瘤原发灶的侵袭性，发现E-cadherin、Snail、Twist蛋白与淋巴结转移密切相关。另有研究[14-16]发现弥漫型胃癌Snail与E-cadherin蛋白下调及肿瘤的远处转移相关，表达阳性提示患者的预后不良。本研究发现Snail蛋白在胃癌原发灶与淋巴结转移灶中的表达水平有显著差异(P<0.05)，且Snail、Twist蛋白阳性表达的患者较阴性表达患者，其预后相对较差，但多因素分析结果提示Snail、Twist蛋白均不是影响胃癌患者预后的独立因素。

综上所述，E-cadherin蛋白的表达情况、组织学分类、有无淋巴结转移为影响胃癌患者预后的独立因素，E-cadherin蛋白表达的患者较不表达的患者表现出更好的预后。

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