补阳还五汤联合脂肪来源干细胞移植对脑缺血大鼠神经功能的影响*

罗 琳 周赛男 佘 颜 雷久士 张 熙

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

·研究报告·

补阳还五汤联合脂肪来源干细胞移植对脑缺血大鼠神经功能的影响*

罗 琳 周赛男 佘 颜 雷久士 张 熙△

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的 探讨补阳还五汤联合脂肪来源干细胞（ADSCs）移植对脑缺血损伤大鼠的神经保护作用。方法 采用线栓法制备大鼠脑缺血模型，大鼠随机分为假手术组、模型组、ADSCs移植组（移植组）、补阳还五汤联合ADSCs移植组（联合组）。各组又分7、14、21 d 3个时间点的亚组，观察各组大鼠不同时间点的神经功能评分、脑梗死面积及脑组织病理形态学变化。结果 与模型组比较，移植组、联合组大鼠造模后14、21 d神经功能评分均显著降低（P<0.05或P<0.01），且联合组大鼠21 d神经功能评分明显优于移植组（P<0.05）；各时间点移植组与联合组大鼠脑梗死面积明显小于同时相的模型组（P<0.01），且14、21 d联合组优于移植组（P<0.05）；造模后HE染色显示模型组大鼠脑组织缺血周边神经元数量减少，细胞明显水肿，治疗后脑组织损伤明显减轻，联合组的病理损伤最轻。结论 补阳还五汤联合ADSCs移植能减轻脑缺血后神经功能损伤，具有脑保护作用。

补阳还五汤 脂肪来源干细胞 脑缺血 神经功能

缺血性脑血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，且有很高的致残率，3/4幸存者常出现不同程度的神经功能缺损。脂肪来源的干细胞（ADSCs）是一类来源于脂肪组织基质的、具有增殖能力和多向分化潜能的成体干细胞［1］。目前国内外一些研究均表明脂肪干细胞可作为有效的神经组织工程种子细胞［2］，但由于干细胞向缺血区迁移能力以及存活率较低，其神经再生效果并不理想［3］。如何高效诱导其分化为治疗部位的功能细胞及促进其与宿主神经网络的形成是干细胞移植的研究重点。补阳还五汤是中医治疗脑缺血的经典名方，此方在临床上广泛应用且疗效确切。本研究通过ADSCs移植于脑缺血模型大鼠，探讨补阳还五汤联合ADSCs移植对缺血性大鼠模型神经功能的保护作用，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠120只，体质量270～300 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 主要试剂 补阳还五汤组方：黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，红花3 g，桃仁3 g，地龙3 g，均购于湖南中医药大学附属第一医院，按标准方法2次煎煮后，每毫升含生药2 g，冷藏备用。水合氯醛、多聚甲醛购于北京鼎国生物公司，TTC（红四氮唑购于Sigma公司）。Ⅰ型胶原酶、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、2.5 g/L胰蛋白酶均购自Gibco公司。

1.3 造模与分组 参照Zea-Longa文献［4］制备右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）大鼠模型，假手术组除不插入线栓，其余相同。参照Longa及Bederson［4-5］的5分制法对术后清醒大鼠进行神经功能评分，剔除1～3分以外者。动物购进后适应性饲养1周，随机分为假手术组、模型组、ADSCs移植组（简称移植组）、补阳还五汤联合ADSCs移植组（简称联合组）。各组再分7、14、21 d 3个时间点，每个时间点10只。

1.4 实验方法 细胞提取、培养及移植取质量80～100 g健康雄性SD大鼠，用100 mL/L的水合氯醛腹腔麻醉，无菌操作下分离大鼠腹股沟处脂肪，用手术剪将脂肪组织剪成碎块，随后加入2 mL 0.75 g/LⅠ型胶原酶置于37℃恒温水浴箱消化，而后加入同体积DMEM液＋100 mL/L胎牛血清（FBS）培养液中和消化液，200目滤器过滤，离心，去除上清后制成单细胞悬液接种于培养瓶中，于37℃、50 mL/L CO2的培养箱内培养，隔天换液，以后每隔3 d换液1次，等细胞80%～90%融合时，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，取3或4代的细胞用于移植，移植细胞个数为1×106，以PBS稀释为30 μL的细胞悬液，在脑立体定位仪下，经侧脑室注入［6］。联合组大鼠于术后清醒起给予14.2 g／kg补阳还五汤药液 （按体表面积60 kg成人用量的3倍换算），每日1次，分别给予7、14、21 d。余下各组动物给予等体积的生理盐水。

1.5 指标检测 （1）神经功能评分。每组每个时间点各取10只大鼠，分别于MCAO术后第7、14、21日对各组大鼠采用修订的神经功能评分（mNSS）方法［7］进行评价，总分为0～18分，分值越大表明神经功能缺损越严重，正常大鼠则为0分。（2）脑梗死面积测定。每组每个时间点各取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取大脑后迅速放置-20℃冰箱冷冻20 min，快速冠状切片6片（2 mm厚），避光状态下用2%的红四氮唑（TTC）液染色30 min，最后置于4%多聚甲醛中固定后拍照。应用Image Tool 3.0图象分析软件计算梗死面积。按Swanson方法消除梗死侧大脑半球因脑水肿造成的误差，梗死面积百分比 （IS）＝（S1-Sr）/2S1× 100%（S1：健侧总面积；Sr：患侧非梗死区面积）。（3）HE染色观察脑组织病理学变化。每组每个时间点取5只大鼠，同脑梗死面积测定取大脑后用上述固定液固定24 h，常规脱水、包埋、冠状连续切片（5 μm厚），HE染色后观察各组大鼠脑组织缺血周边区神经细胞形态学改变。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（s）表示，多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经功能mNSS评分检测 见表1。假手术组各时间点神经功能评分正常；其余各组大鼠造模后均出现不同程度神经功能缺损，其分值随着缺血的时间延长而逐渐减少；移植组移植后7 d神经功能mNSS评分与模型组比较差异均无显著性（P＞0.05），但14、21 d其mNSS评分均显著低于模型组（P＜0.05）；而联合组则在7、14、21 d的mNSS评分显著优于模型组 （P＜0.05）；造模后，与移植组相比，联合组14 d的mNSS评分差异无统计学意义 （P＞0.05），而联合组21 d的mNSS评分差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠神经功能mNSS评分比较（分，s）

表1 各组大鼠神经功能mNSS评分比较（分，s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与移植组比较，△P＜0.05。下同。

组别n 21 d 7 d 14 d假手术组10 0模型组 10 8.42±1.58移植组 10 6.88±1.45*0 0 10.65±1.68 9.58±1.66 9.93±1.60 8.13±1.38*联合组 10 5.36±1.15**△9.25±1.44*7.35±1.24*

2.2 脑梗死面积测定 见表2。通过TTC染色计算各时间点各组大鼠脑梗死面积，假手术组未见梗死灶形成，着比较均匀深红色；余下各组局部梗死灶区显示白色，位于缺血侧大脑皮质和海马周围，与模型组比较，移植组和联合组各时间点的脑梗死面积明显缩小（P＜0.01）；而移植组与联合组相比，14 d和21 d联合组大鼠脑梗死面积差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 大鼠脑梗死面积百分比结果（%，s）

表2 大鼠脑梗死面积百分比结果（%，s）

组别n 21 d 7 d 14 d假手术组5 0模型组 5 22.66±2.22移植组 5 10.48±1.01**0 0 28.58±2.02 26.42±1.08 20.50±2.05**13.44±2.11**联合组 5 7.75±1.98**△18.81±1.93**10.26±1.59**△

2.3 脑组织缺血周边区病理变化 见图1。光镜观察HE染色结果显示：假手术组神经细胞胞体完整、形态正常，细胞核着色均匀、可见清晰核仁，无神经细胞的损伤、水肿等改变。模型组造模后7 d缺血周边区神经细胞数量明显减少，部分神经细胞胞体缩小、轮廓不清，胞核固缩深染、碎裂溶解，脑组织明显水肿，纤细胞及其毛细血管周围间隙明显增大；14、21 d神经细胞水肿逐渐减轻、坏死逐渐减少。各时间点大鼠的损伤程度比较，移植组和联合组较模型组明显减轻，且联合组的病理损伤最轻。

图1 各组不同时间点脑组织细胞形态变化（HE染色，400倍）

3 讨 论

近年来，ADSCs由于增殖速度快，易于体外扩增和纯化，且其来源广泛，还可以通过自体取材，从而避免了免疫排斥问题，已经成为干细胞治疗脑缺血疾病研究的热点。有实验通过对脑缺血大鼠侧脑室注射ADSC的方法，可以改善大鼠神经功能的缺损症状［8］。但也有研究认为由于脑缺血区炎症反应、血液循环障碍等因素，干扰了移植干细胞生存的内环境，最终影响到干细胞在脑组织的迁移、存活、分化及再生能力［9］。中医从整体观念和辨证论治角度治疗疾病，中医药通过对干细胞移植后存活、诱导分化方面发挥其多靶点、多效应作用，一些研究将干细胞移植与中药干预相结合，起到协同增效、优势互补的功效［10］。

缺血性脑血管疾病属于中医学“中风”的范畴，而气虚和血瘀是中风病病因病机中的关键证候因素。具有益气活血功效的补阳还五汤是中医治疗中风的经典名方，临床上治疗脑缺血及其后遗症均疗效确切。一些实验室研究也表明补阳还五汤能促进脑缺血后神经干细胞增殖、迁移和分化，并且能促进移植的干细胞存活，促进神经功能的恢复［11-12］。因此，本实验将补阳还五汤和ADSCs移植联合治疗脑缺血大鼠模型。实验研究显示，联合组与移植组均可以减少脑缺血神经功能评分、缩小脑梗死面积、改善缺血脑组织神经细胞形态，对局灶性脑缺血损伤有保护作用，且联合组的疗效显著优于单纯移植组。其机制可能是在脑缺血的急性期起到了脑保护作用，抑制了大量神经元凋亡与死亡，促进缺血后脑组织再生修复代偿，明显改善了神经细胞形态结构，促进脑缺血损伤后组织修复，解决了脑缺血损伤的核心问题——神经元损伤引起的神经功能障碍。

综述所述，通过本实验表明，补阳还五汤联合脂肪干细胞具有协同增效的作用，为中药复方联合干细胞移植治疗脑缺血疾病的科学研究和临床应用提供了实验依据，但其相互影响发挥作用的确切机制尚待进一步的研究，同时对于干细胞移植的安全性和远期疗效等问题还需进一步的研究完善。

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Effect of Buyanghuanwu Decoction Combined with Adipose-derived Stem Cells Transplantation on Nerve Function in Experimental Rats with Cerebral Ischemia

LUO Lin，ZHOU Sainan，SHE Yan，et al. Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China

Objective：To explore the protective effects of Buyanghuanwu Decoction combined with adipose-derived stem cells（ADSCs）transplantation on cerebral ischemia in rat.Methods：Rats were randomly divided into the sham operation group，the model group，the ADSC transplantation group，the Buyanghuanwu Decoction combined with ADSCs group.Cerebral ischemia animal models were established with nylon thread.Each group was divided into 3 sub-groups according to 3 time points including the 7 d，the 14 d and the 21 d.Some indicators were observed in each group at different time points such as neurological function，cerebral infarction size and brain issue morphological changes.Results：Compared with model group，the neurological score were significantly decrease in transplantation group and combination group at 14 d and 21 d after MCAO（P<0.05 or P<0.01）.This index in the combination group was better than that in the transplantation group at 21 d（P<0.05）.The infarction area in transplantation group and combination group were significantly decreased compared with model group at the same time-phase.The size in the combination group was better than that in the transplantation group at 14 d and 21 d（P<0.05）.After MCAO，HE staining showed injuried never cells with twisted axonal processes and cells loss were evident in the ischemia penumbra，and those changes were very few in each treatment group especially the combination group.Conclusion：Buyanghuanwu Decoction combined with ADSCs transplantation can improve cerebral ischemic injury neurological recovery.It has cerebral protective effect．

Buyanghuanwu Decoction；Adipose-derived stem cells；Cerebral ischemia；Nerve function

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1994-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.012

2014-08-02）

湖南省教育厅科研项目（12C0269）；湖南中医药大学重点学科（病理学与病理生理学）

△通信作者