益气化痰通络法对大鼠肺纤维化的干预作用及其机制的研究*

郭 芳于文成林存智宋晓霞季维娜蔺 晨

（1.青岛大学，山东 青岛 266071；2.青岛大学附属医院，山东 青岛 266003）

·研究报告·

益气化痰通络法对大鼠肺纤维化的干预作用及其机制的研究*

郭 芳1于文成2△林存智2宋晓霞2季维娜2蔺 晨2

（1.青岛大学，山东 青岛 266071；2.青岛大学附属医院，山东 青岛 266003）

目的 研究益气化痰通络法对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的干预作用，以及对血清中转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响。方法 雄性Wistar大鼠90只，随机分成对照组15只，模型组75只，模型组经博来霉素造模后，随机分成中药组、激素组、乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组和生理盐水组（模型对照组）各15只，正常鼠粮喂养并每日给药，分别于第15日、30日和45日后处死大鼠，对大鼠肺组织做病理切片HE染色，并用ELISA法检测血清中TGF-β1、TNF-α的表达。结果 HE染色示中药组的肺泡炎症、肺纤维化程度较模型对照组显著减轻，中药组大鼠血清中TGF-β1、TNF-α的表达显著低于模型对照组，差异具有统计学意义（均P<0.05或P<0.01）。结论 益气化痰通络法对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化具有干预作用，其机制可能为减少血清中TGF-β1、TNF-α的表达。

益气化痰通络法 肺纤维化 TGF-β1TNF-α

肺纤维化是进展性肺实质疾病，其病程高度可变，诊断后的中位生存期仅为3～5年［1］。吸烟，年龄增大、环境污染等都可成为其发病原因［2］，其发病机制尚未明确，仍缺乏有效的治疗手段，临床上主要以糖皮质激素和免疫抑制剂治疗为主，有效率较低且副作用较大，其临床价值争议较大［3］。近年来，中药对肺纤维化治疗作用得到关注，益气化痰通络法组方是由黄芪、白术、川芎、丹参、半夏组成的复方制剂，针对肺纤维化发病机制，具有补益肺气、祛除痰湿、活血通络的作用。本研究通过动物实验，观察益气化痰通络法对肺纤维化的干预作用，并研究其可能机制，为寻找新的肺纤维化治疗方案奠定基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，清洁级，体质量（200±25）g。购买于青岛派特福德白鼠养殖专业合作社，许可证号：scxk鲁20130001，清洁级动物房饲养。

1.2 药物及试剂 注射用盐酸博来霉素A5（由日本化药株式会社生产，批号740141）；中药（益气化痰通络法方药，采用黄芪15 g，白术10 g，川芎10 g，丹参20 g，半夏10 g，制成水煎剂150 mL，由北京同仁堂青岛药店有限责任公司制备）；强的松粉末（上海源叶生物科技有限公司提供，批号AF0219LB14）；乙酰半胱氨酸 （上海源叶生物科技有限公司提供，批号WO1024YA413）、罗红霉素（上海源叶生物科技有限公司提供，批号WO1011SA13）；大鼠TGF-β1和TNF-α的ELISA试剂盒（美国RD System公司提供）。

1.3 实验仪器 离心机（Eppendorf公司，型号Centrifuge 5415D）；酶标仪（美国biotek生产，型号biotek808）；显微镜（OLYMPUS，型号CX31）；-20℃冰箱（由海尔集团提供，型号BCD-215KCFM）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，型号XP1203S）；

1.4 模型制备 采用一次性气管内注入博来霉素法复制大鼠肺纤维化模型，具体方法：10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，将其仰卧固定于鼠板上，消毒后沿颈部正中线切开颈部皮肤，钝性分离颈部肌肉暴露出气管，在两个气管软骨之间朝向心端注入博莱霉素A5（5 mg/kg，溶于0.2 mL的0.9%氯化钠注射液中），迅速竖起大鼠并旋转使药物均匀分布到肺组织中，后消毒缝合颈部切口。对照组采用相同方法注入等量0.9%氯化钠注射液，以上操作均遵循无菌原则。

1.5 分组及给药 90只大鼠采用随机分为对照组15只和模型组75只，模型组经博来霉素造模后，随机分为中药组、激素组、乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组和模型对照组各15只；对照组正常鼠粮喂养；自造模后第2日开始，中药组给予益气化痰通络法的中药水煎剂5 mL/次，每日1次；激素组给予强的松5 mg/kg，每日1次；乙酰半胱氨酸组给予乙酰半胱氨酸4 mg/kg，每日3次；罗红霉素组给予罗红霉素5 mg/kg，每日1次；模型对照组给予0.9%氯化钠注射液，2 mL，每日2次；均采用灌胃方法给药，其中强的松、乙酰半胱氨酸、罗红霉素制成相应浓度的水溶液或混悬液。

1.6 样本采集及检测 于第1、15、30及45日分3批处死大鼠，每批为各组大鼠数量的1/3，采用腹腔注射过量10%水合氯醛法处死大鼠，腹主动脉取血、离心，保存血清于-20℃冰箱中以备ELISA法测定血清因子；打开胸腔取大鼠左肺组织，用4%甲醛溶液固定，以备HE染色。（1）组织病理学观察。将肺组织进行脱水、固定、包埋、切片、HE染色制成病理切片。在显微镜下观察肺纤维化的程度，分级标准按Szapiel等［4］方法，即0级：无肺纤维化（-）。1级：轻度肺纤维化（＋）受累面积少于全肺20%。2级：中度肺纤维化（＋＋），占全肺面积的20%～50%。3级：重度肺纤维化（＋＋＋），受累面积＞50%，肺泡结构紊乱。将等级资料为用计量资料表示，（-）以0表示，（＋）以1表示，（＋＋）以2表示，（＋＋＋）以3表示。（2）血清ELISA法测定。取出保存于-20℃冰箱中的血清，严格按照试剂盒步骤测定大鼠血清中的TGF-β1和TNF-α。

1.7 统计学处理 应用SPSS Statisics V17.0统计软件分析。数据结果均以（s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理学结果 各组大鼠不同阶段的肺纤维化程度结果见表1，肺组织结构如图1所示。对照组：均为正常肺泡结构，未出现异常的病理变化。模型对照组：15 d时肺泡腔及肺泡间隔炎症细胞浸润明显，肺泡间隔增宽，30 d及45 d时肺泡壁增厚、肺泡结构破坏，可见大量成纤维细胞聚集，纤维化程度较重。各治疗组的肺纤维化程度较相应时间段模型对照组均显著减轻（P＜0.05或P＜0.01），中药组用药15 d、30 d、45 d后，肺泡炎症及肺纤维化程度均较相应时间段的模型对照组显著减轻（P＜0.01）；中药组与激素组的差异无统计学意义（P＞0.05）；30 d、45 d时中药组较乙酰半胱氨酸组肺纤维化程度的显著减轻（P＜0.05），15 d时差异无统计学意义；中药组3个时间段的肺纤维化程度较罗红霉素组显著减轻（P＜0.05）。

表1 各组大鼠肺纤维化程度（s）

表1 各组大鼠肺纤维化程度（s）

模型组30 d时n＝4，其余各组n＝5。与对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中药组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。下同。

45 d对照组模型对照组 2.80±0.45*中药组 1.23±0.84△△组别15 d 30 d 2.60±0.55*2.75±0.50*0.80±0.45△△1.02±0.71△△激素组0.80±0.45△△1.02±0.02△△乙酰半胱氨酸组 1.41±0.55△△1.80±0.45△#2.03±0.10△#罗红霉素组 1.60±0.55△△#1.80±0.84△#2.02±0.71△#1.21±0.45△△

图1 各组大鼠不同时间段肺组织结构（HE染色，100倍）

2.2 各组大鼠血清TGF-β1的含量 见表2。与对照组相比，模型对照组大鼠血清的TGF-β1在3个时间段均明显升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，中药组、激素组、乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组大鼠血清的TGF-β1在3个时间段均明显降低（P＜0.01）；中药组与激素组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；中药组较乙酰半胱氨酸组大鼠血清TGF-β1明显降低 （P＜0.01或P＜0.05）；中药组较罗红霉素组大鼠血清TGF-β1明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠血清TGF-β1含量比较（ng/L，s）

表2 各组大鼠血清TGF-β1含量比较（ng/L，s）

15 d 30 d 133.43±4.38 134.59±4.78 213.11±8.24*205.11±13.85*143.41±4.51△△136.32±2.83△△激素组45 d对照组 134.91±3.77模型对照组 221.40±10.49*中药组 135.69±0.73△△组别142.22±4.70△△137.50±2.70△△乙酰半胱氨酸组 175.41±15.03△△##166.36±10.28△△##164.43±24.15△△#罗红霉素组 173.20±18.45△△##163.51±10.28△△#159.56±19.32△△#134.91±2.82△△

2.3 各组大鼠血清TNF-α的含量 见表3。与对照组相比，模型对照组大鼠血清的TNF-α在3个时间段均明显升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，中药组、激素组、乙酰半胱氨酸组、罗红霉素组大鼠血清的TNF-α在3个时间段均明显降低（P＜0.01）；中药组与激素组相比各时间段差异均无统计学意义（P＞0.05）；中药组较乙酰半胱氨酸组大鼠血清TNF-α明显降低 （P＜0.01或P＜0.05）；中药组较罗红霉素组大鼠血清TNF-α明显降低（P＜0.05）。

3 讨 论

肺纤维化主要特征为纤维化改变导致了肺泡结构的破坏，是渐进性进展性肺疾病［5］。肺纤维化患者的生活质量差，且干预和治疗该病策略的研究进展并不显著。肺纤维化在中医上称为 “短气”、“喘证”、“肺痿”、“肺痹”等［6］，其发病的主要机制是邪盛正虚，且以正气亏虚为本，正气不足，无力推动血液正常运行，且久病入络，形成血瘀气虚之证候［7］。近年，中药抗肺纤维化的作用得到广泛的研究并显示出良好的应用前景［8］。据报道，黄芪［9］、白术可起到补肺气的作用，肺气得以补充，血液即可得到正常运行；川芎、丹参有活血化瘀的作用，此类药物使血运得通；半夏则可化浊祛痰、促使肺络畅通、肺气输布，有利于肺纤维化的治疗，但目前尚没有相关研究将这几种中药组成复方制剂来探讨其对肺纤维化的作用，并且其作用的分子机制也研究尚少。本研究用博来霉素复制大鼠肺纤维化模型，采用益气化痰通络法进行干预，并与激素、罗红霉素、乙酰半胱氨酸的疗效进行对比，显示出益气化痰通络法具有干预肺纤维化的作用。

表3 各组大鼠血清TNF-α含量比较（ng/L，s）

表3 各组大鼠血清TNF-α含量比较（ng/L，s）

15 d 30 d 148.61±5.61 149.84±5.19 280.06±15.85*277.21±18.90*169.76±4.00△△165.27±4.00△△激素组45 d对照组 151.18±3.74模型对照组 289.67±12.06*中药组 158.32±2.00△△组别159.32±10.19△△156.99±12.83△△乙酰半胱氨酸组 200.80±5.81△△##191.60±6.01△△#179.12±14.29△△#罗红霉素组 183.44±11.50△△#184.58±14.58△△#179.40±9.26△△#155.29±12.28△△

TGF-β1在肺纤维化的发生发展过程中起着显著作用，可由肺组织中肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞、成肌纤维细胞等产生，它产生过多或其促纤维化作用增强，都可导致纤维化启动过程中的异常伤口愈合反应。肺纤维化发病过程中的细胞活化、迁移、侵入、增生性改变都与TGF-β1诱导的稳态微环境紊乱相关［10］。TGF-β1可诱导血小板衍生生长因子（PDGF）增殖而募集巨噬细胞、成纤维细胞，可诱导前胶原mRNA产生，诱导胶原酶抑制物-基质金属蛋白酶（MMP）合成而使胶原产生增加、降解减少，可加重上皮细胞损伤、诱导上皮细胞凋亡［11］，促进上皮-间质间转化（EMT）［12］，TGF-β1还可刺激其他促炎性和促纤维化细胞因子，如TNF-α、PDGF、IL-1β、IL-13等的分泌，也可促进自身分泌，从而增强和延续纤维化反应。TNF-α是上调肺纤维化的一种关键的促炎细胞因子［13］，可由肺泡巨噬细胞表达。TNF-α的主要病理作用为通过聚集炎症细胞、激活中性粒细胞促进肺泡炎症，通过刺激细胞凋亡再生、肺成纤维细胞的增殖而促进纤维化形成［13］。研究报道，大鼠和小鼠体内的TNF-α表达过度均可诱导肺纤维化发生，而敲除TNF-α受体的小鼠可免受石棉引起的肺纤维化，更有动物实验表明，在博来霉素诱导的小鼠体内，TNF-α可随TGF-β1的表达而表达增多，并且可与核因子-κB信号通络（NF-κB）相互促进，TNF-α在肺纤维化的发病过程中起到中心作用［14］。TGF-β1和TNF-α均为肺纤维化过程中的重要细胞因子，本实验通过测定其在血清中的表达以反应大鼠肺纤维化进展情况及药物的干预作用。

本实验采用一次性气管内注入博来霉素法复制大鼠肺纤维化模型［15］。模型对照组大鼠体型消瘦、体质量下降，唇舌及四肢末端紫绀，并有咳嗽及气促等症状，肺组织病理学检查中第15日出现了明显的肺泡炎症，第 30日、45日可见明显的肺间质纤维化；TGF-β1、TNF-α的测定值均较相应时间段的对照组的数值明显升高，说明本实验造模成功。各治疗组大鼠的肺组织病理学观察结果示肺纤维化程度均好于模型对照组，测得的TGF-β1、TNF-α值均显著低于模型组，说明中药、激素、乙酰半胱氨酸、罗红霉素均对肺纤维化有不同程度的干预作用。其中，中药组大鼠与相应时间段的模型对照组比较，大鼠肺组织HE染色示肺泡炎症及纤维化程度显著减轻，测得的TGF-β1、TNF-α数值均较相应时间段的模型对照组数值明显降低，说明所用中药对大鼠肺纤维化具有干预作用，可延缓肺纤维化的进展，且其作用机制可能为下调大鼠血清中TGF-β1、TNF-α的表达。中药组与激素组比较，大鼠肺组织肺纤维化的程度以及TGF-β1、TNF-α值差异无统计学意义。中药组与乙酰半胱氨酸组和罗红霉素组相比，中药组大鼠的肺纤维化程度及TGF-β1、TNF-α值在相应时间段显著降低，说明本实验所用的中药复方制剂对肺纤维化的干预作用较罗红霉素及乙酰半胱氨酸强。

本实验所用的益气化痰通络法组方由益气药黄芪、白术，化瘀通络药川芎、丹参和化痰药半夏组成，实验结果表明该中药方剂对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化具有干预作用，且其作用机制可能为降低血清中TGF-β1、TNF-α的表达，以期为肺纤维化的治疗开辟新的思路。但其具体作用机理以及最佳用药疗程、用药剂量尚有待于进一步研究。

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Effect of Yiqihuatantongluo Decoction on Rats with Pulmonary Fibrosis

GUO Fang1，YU Wencheng2，LIN Cunzhi2，et al. 1 Qingdao University，Shangdong，Qingdao 266071，China；2 The Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong，Qingdao 266003，China

Objective：To study the intervention effect of Yiqihuatantongluo Decoction on rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin and impact of it on serum TGF-β1and TNF-αlevel.Methods：90 male Wistar rats were randomly divided into control group（15 cases）and model group（75 cases）induced by bleomycin.Then，the model group were again randomly divided into traditional Chinese medicine group，hormone group，acetylcysteine group，roxithromycin group and normal saline group（model control group），with 15 cases in each group.Normal food and corresponding drugs were given daily.The rats were partially killed after 15th d and 30th d，and all killed after 45 d.Lung tissue was made pathological section and HE staining.ELISA method was used to detect the expressions of TGF-β1and TNF-α in serum.Results：HE staining showed that alveolar inflammation and the degree of pulmonary fibrosis of rats in the traditional Chinese medicine group reduced significantly，and the expressions of TGF-β1，TNF-αin the serum of Chinese traditional medicine group are significantly lower than those of model group.Conclusion：Yiqihuatantongluo Decoction has intervention effect on rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin，and its mechanism may be related to reducing the expressions of TGF-β1and TNF-αin serum.

Yiqihuatantongluo method；Pulmonary fibrosis；TGF-β1；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1984-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.008

2014-07-06）

山东省中医药科技计划课题（2013-231）

△通信作者