加味清营颗粒对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤模型炎性因子的影响*

刘荣荣彭 敏马宏博△

（1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东大学附属省立医院，山东 济南 250014）

·研究报告·

加味清营颗粒对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤模型炎性因子的影响*

刘荣荣1彭 敏2马宏博2△

（1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东大学附属省立医院，山东 济南 250014）

目的 观察加味清营颗粒对急性肺损炎性因子的影响。方法 144只wistar大鼠随机分为空白对照组，模型组，加味清营颗粒低、中、高剂量组，地塞米松组，每组24只，连续灌胃6 d，尾静脉注射LPS（5 mg/kg）后于1，3，5 h不同时相处死大鼠。采用ELISA法检测肺泡灌洗液（BALF）中炎症介质白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-10的含量变化；用Bradford检测BALF蛋白含量；HE染色观察病理切片。结果 模型组各时相炎症因子均明显高于其他各组；与模型组比较，各治疗组均可显著降低的炎症介质IL-1β、TNF-α、IL-10的表达（P<0.05）；与地塞米松组比较，加味清营颗粒低、中、高剂量组在1 h、3 h时相降低IL-1β、TNF-α的表达有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比较，各治疗组均可显著降低的BALF蛋白的表达（P<0.05）；与地塞米松组比较，加味清营颗粒各时相剂量组在降低BALF蛋白的表达方面有统计学意义（P<0.05）；肺组织HE染色病理结果示肺泡结构破坏或实变，肺泡隔增厚显著，毛细血管充血明显，肺泡腔内、细动脉周围和细支气管壁可见成堆炎症细胞浸润，而加味清营颗粒各剂量组肺组织病理均有较大程度的改善。结论 加味清营颗粒可降低急性肺损伤时炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10的释放，降低BALF中蛋白的含量，从而减轻肺部炎症细胞浸润，对损伤的肺组织起到修复保护的作用。

加味清营颗粒 急性肺损伤 炎症介质

急性肺损伤是全身炎症反应综合征在肺部的表现，是严重创伤或感染后出现最早及发生率最高的并发症之一。本实验通过观察加味清营颗粒对内毒素性肺损伤大鼠肺组织中炎症介质白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-10表达的影响，及肺泡灌洗液（BALF）中蛋白的含量和肺组织病理切片变化，观察其对内毒素性急性肺损伤的治疗效果，指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 加味清营颗粒由水牛角、地黄、金银花、连翘、玄参、黄连、麦冬、竹叶、丹参、西洋参、大黄组成，药品采用三九医药生产的配方颗粒，购自于山东省立医院中药房。地塞米松注射液（郑州卓峰制药有限公司，每支5 mg，批号H41020055）；脂多糖（美国Sigma公司，O55：B5）。ELISA检测试剂盒（Invitrogen）

1.2 动物 健康清洁级雄性wistar大鼠，体质量（250±20）g，由山东大学医学院动物中心提供。

1.3 造模与分组 将144只大鼠随机分为6组，空白对照组，模型对照组，加味清营颗粒低、中、高剂量组，地塞米松组，每组24只。适应性饲养1周后开始灌胃，空白对照组与模型对照组每日每次予生理盐水2 mL灌胃，加味清营颗粒低、中、高剂量组每日分别给予

1.2 、1.8、2.4 g/100 g体质量，地塞米松组每日给2.5 mg/ 100 g体质量灌胃。灌胃6 d后，除空白对照组向大鼠尾静脉静推生理盐水2.5 mL/kg外，其余各组向大鼠尾静脉静推内毒素5 mg/kg。后放回笼中自由活动及饮食，观察各组呼吸变化情况。

1.4 标本采集与检测 以上各组分别于注射LPS后 1、3、5 h，10%水合氯醛麻醉处死大鼠，开胸取肺，每次用2 mL生理盐水灌洗左肺，共3次，合并3次收集到的BALF-20℃冻存待测。采用ELISA法检测BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10的变化；用考马斯亮蓝法（Bradford）检测BALF中蛋白含量；取右肺上叶，制作石蜡切片，行HE染色，普通光学显微镜下观察肺组织病理变化。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（s）表示，组间差异采用单因素方差分析和q检验，组内对比采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10的水平 见表1～3。结果显示，与空白对照组相比，模型组BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10含量明显升高，具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组大鼠BALF中 IL-1β、TNF-α、IL-10水平均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与地塞米松组比较，加味清营颗粒各组在1、3 h时相炎症介质IL-1β、TNF-α、IL-10均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），在5 h时相无显著差异（P＞0.05）。

表1 各组BALF中IL-1β的含量变化（pg/mL，s）

表1 各组BALF中IL-1β的含量变化（pg/mL，s）

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与地塞米松组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。下同。

组别n 5 h空白对照组 8 17.49±0.16模型组 8 36.285±0.85**中药低剂量组 8 30.54±2.02**△△1 h 3 h 18.12±0.22 19.68±1.03 35.86±0.21**37.93±3.55**27.17±1.19**△△29.06±1.78**△△中药中剂量组 8 27.62±1.04**△△25.34±1.37**△△＃26.27±0.45**△△##中药高剂量组 8 22.27±1.09**△△＃24.59±2.36**△△##25.97±1.64**△△地塞米松组 8 30.70±4.11**△28.09±0.82**△△28.44±3.47**△△

表2 各组BALF中TNF-α的含量变化（pg/mL，s）

表2 各组BALF中TNF-α的含量变化（pg/mL，s）

组别n 5 h空白对照组 8 162.98±33.71模型组 8 283.99±1.30**中药低剂量组 8 221.46±19.42*△△1 h 3 h 143.22±5.29 166.31±29.75 296.06±6.37**292.63±5.35**219.48±5.77**△△##230.30±11.56**△△#中药中剂量组 8 224.84±2.67*△△214.49±15.98**△△##220.11±8.59**△△##中药高剂量组 8 209.28±19.16**△△##217.04±7.01*△△##229.99±30.67*△地塞米松组 8 261.20±13.07**△△248.84±7.03**△△224.84±4.60*△△

表3 各组BALF中IL-10的含量变化（pg/mL，s）

表3 各组BALF中IL-10的含量变化（pg/mL，s）

组别n 5 h空白对照组 8 30.47±0.59模型组 8 57.72±1.27**中药低剂量组 8 53.09±4.49**△1 h 3 h 31.43±0.35 29.76±0.80 55.98±1.58**58.35±2.25**43.60±0.94**△△##48.94±4.42**△△中药中剂量组 8 45.17±0.47**△△36.18±0.76**△△##46.07±5.48**△△中药高剂量组 8 34.13±0.78**△△##41.85±2.88**△△47.60±5.66**△△地塞米松组 8 48.94±1.20**△△47.71±6.03**△△50.90±4.87**△

2.2 大鼠BALF中蛋白含量的变化 见表4。除空白对照组以外，各组的BALF蛋白水平均有升高；与模型组比较，各治疗组蛋白含量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；加味清营颗粒低、中剂量组蛋白升高值明显低于地塞米松组，差异具有统计学意义 （P＜0.01），高剂量组与地塞米松组比较无明显差异 （P＞0.05）。

2.3 病理形态学的变化 光镜下见空白对照组肺泡结构完整，无水肿，肺泡隔未见增厚，偶可见少量炎症细胞浸润（见图1～3）。模型组肺泡结构破坏或实变，肺泡隔增厚显著，毛细血管充血明显，肺泡腔内、细动脉周围和细支气管壁可见成堆炎症细胞浸润和大量红细胞渗出，炎症细胞主要以中性粒细胞、淋巴细胞为主，其中病理损伤以5 h最为明显（见图1～3）。各用药组亦存在肺泡结构破坏或实变、肺泡隔增厚、毛细血管充血、肺泡腔内、细动脉周围和细支气管壁可见成堆炎症细胞浸润和红细胞渗出情况，但均较模型组有较大程度的改善。光镜下观察加味清营颗粒各组炎症变化均比地塞米松组炎症轻。

表4 各组BALF中蛋白含量变化（μg/mL，s）

表4 各组BALF中蛋白含量变化（μg/mL，s）

组别n 5 h空白对照组 8 1.72±0.10模型组 8 14.28±1.59**中药低剂量组 8 8.52±2.23**△△##1 h 3 h 1.03±0.35 1.45±0.08 8.90±1.57**11.69±1.16**5.07±1.22**△△##6.60±1.17**△△##中药中剂量组 8 6.85±1.10**△△##4.38±0.65**△△##5.36±0.86**△△##中药高剂量组 8 2.68±0.56**△△3.25±0.36**△△4.25±0.90**△△地塞米松组 8 2.61±0.43**△△3.35±0.46**△△3.63±0.44**△△

图1 各组1 h时HE染色（100倍）

3 讨 论

图2 各组3 h时HE染色（100倍）

图3 各组5 h时HE染色（100倍）

急性肺损伤是由感染、大面积肺栓塞、外伤等多种因素所致急性肺部损伤［1-2］。免疫反应失衡是引起危重患者死亡的重要因素，其中过度炎症反应是危重症患者机体免疫反应失衡的重要环节［3-4］。急性肺损伤发病的关键是致病因子激活多种炎症细胞，释放一系列炎症介质，这些炎症介质可再度激活炎症细胞，以“自分泌”或“旁分泌”的方式释放更多的炎症介质或细胞因子，导致瀑布式的炎症反应，形成肺过度损伤［5］。肺组织细胞中IL-1β、TNF-α的过量表达参与介导了急性肺损伤的发生［6］。其中IL-10是一种重要的抑制性细胞因子，对机体的免疫功能和炎症过程具有重要的调节活性。研究发现，IL-10能通过广泛抑制 IL-1β、TNF-α等炎症介质的产生，参与体内内毒素介导的TNF-α负反馈调节［7-8］。

内毒素类似于中医学的“热毒”，其造成急性肺损伤的临床表现类似于中医的温病。根据温病卫气营血辨证施治原则，大多数医家选用清热解毒、活血化瘀、通里攻下、益气固脱法等方法治疗急性肺损伤。笔者认为内毒素所致之急性肺损伤，乃邪热内传营分，耗伤营阴所致，遵《素问·至真要大论》“热淫于内，治以咸寒，佐以甘苦”之旨，治宜咸寒清营解毒为主，辅以透热养阴。清营汤出自于《温病条辨》，是治疗温病热入营血分的经典方。而加味清营颗粒系在清营汤基础上加用大黄、西洋参。方中苦咸寒之水牛角清解营分之热毒，为君药。热伤营阴，又以生地黄凉血滋阴、麦冬清热养阴生津、玄参滋阴降火解毒，诸药共用，既可甘寒养阴保津，又可助君药清营凉血解毒，共为臣药。君臣相配，咸寒与甘寒并用，清营热而滋营阴，祛邪扶正兼顾。温邪初入营分，故用银花、连翘、竹叶清热解毒，轻清透泄，使营分热邪有外达之机，促其透出气分而解，此即“入营犹可透热转气”之具体应用；黄连苦寒，清心解毒；丹参清热凉血，并能活血散瘀，可防热与血结；由于热病伤阴，配伍西洋参能够清热养阴，益气生津，现代药理研究表明西洋参具有提高机体免疫力，抗缺氧，能够降低血液凝固性、抑制血小板凝聚等作用；大黄清热泻火，凉血解毒，现代药理研究表明，大黄具有抗炎、解热、抑制非特异性免疫功能等作用。上述7味均为佐药。本方的配伍特点是以清营解毒为主，配以养阴生津和“透热转气”，使入营之邪透出气分而解，诸症自愈。既往研究表明西洋参、大黄组成的扶正排毒液［9］对内毒素休克肺损伤具有保护作用，二者可抑制TNF-α和IL-10的过度分泌，调整感染状态下的免疫紊乱、炎症与抗炎失衡，降低重要脏器的损害。

本研究通过尾静脉注射脂多糖制作大鼠内毒素急性肺损伤模型，观测不同时间点BALF中炎症因子的变化。从实验结果可以看出，各用药组均能够显著降低炎症介质IL-1β、TNF-α、IL-10的释放，提示加味清营颗粒可抑制IL-1β、TNF-α等炎症介质的产生，其中5 h以内加味清营颗粒高剂量组效果尤为明显；病理切片显示在各时间段加味清营颗粒均可有效控制炎症反应。由上所述，可以看出加味清营颗粒可减轻炎症的“级联式”反应，进而减轻肺组织损伤，阻止炎症的发生、发展，对肺组织有保护作用。其具体的抗炎保护机制有待进一步研究。

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Effects of Modified Qingying Granule on Inflammatory Mediator Induced by Lipopolysaccharide in Rat Model with Acute Lung Injury

LIU Rongrong1，PENG Min2，MA Hongbo2. 1 Shandong Traditional Chinese Medicine University，Shandong，Jinan 250014，China；2 Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Shandong，Jinan 250014，China

Objective：To investigate the effect of Modified Qingying Granule on inflammatory mediator of acute lung injury.Methods：144 Wistar rats were randomly divided into blank control group，model group，Modified Qingying Granule low dose group，medium dose group and high dose group，and dexamethasone group（n=24）. Continuous intragastric administration lasted 6 days.After tail vein injection of LPS（5 mg/kg），rats were executed at 1st，3rd，and 5th hour later.ELISA was used to detect the content changes of inflammatory mediators such as IL-1β，TNF-α and IL-10 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）.BALF protein was examined by Bradford.The pathological section was made into HE stainining.Results：Inflammatory cytokines at different time points of model group were significantly higher than those in the other groups.Compared with model group，expressions of inflammatory mediators of treatment groups decreased（P<0.05）.Compared with dexamethasone group，Modified Qingying Granule low，midium and high dose groups at 1 h and 3 th hour had statistical significance in reducing IL-1β and TNF-α expressions（P<0.05）.Compared with model group，expression of BALF protein in treatment groups significantly decreased（P<0.05）.Compared with dexamethasone group，Modified Qingying Granule had statistical significance in reducing BALF protein expression（P<0.05）.Lung tissue HE staining pathological results revealed damaged or changed alveolar structure，thickened alveolar septa，capillary congestion，and visible piles of inflammatory cell infiltration in alveolar space，around arteriole and in bronchiolar wall.Modified Qingying Granule groups had a greater degree of improvement in lung tissue pathology.Conclusion：Modified Qingying Granule can reduce the expressions of inflammatory mediators such as IL-1β and TNF-α，increase expression of IL-10，reduce the content of bronchoalveolar lavage fluid protein，so as to reduce the pulmonary inflammatory cellinfiltration and to repair the protective function of damaged lung tissue.

Modified Qingying Granule；Acute lung injury；Inflammatory mediator

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1964-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.002

2014-08-14）

国家自然科学基金青年基金项目（81202675）；山东省自然科学基金青年基金项目（ZR2011HQ052）

△通信作者