BMP-2基因转染对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和钙含量的影响

张雁儒，张 辉，马 辉，王义生

1)郑州大学国际教育学院医学实验中心 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052 3)郑州大学临床医学系 郑州 450052 4)洛阳市第三人民医院骨科 471002

BMP-2基因转染对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性和钙含量的影响

张雁儒1,2)，张 辉3)，马 辉4)，王义生2)#

1)郑州大学国际教育学院医学实验中心 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052 3)郑州大学临床医学系 郑州 450052 4)洛阳市第三人民医院骨科 471002

#通讯作者，男，1951年2月生，硕士，教授，研究方向：骨坏死的发病机制与防治、关节脊柱外科，E-mail:wangyisheng@zzu.edu.cn

骨形成蛋白2；骨髓间充质干细胞；碱性磷酸酶；钙;兔

目的：观察骨形成蛋白2(BMP-2)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)碱性磷酸酶(ALP)活性和钙含量的影响。方法成年大耳白兔16只，经髂后上嵴抽取骨髓组织混合后培养、分离BMSCs。取第3代细胞，采用电转法转染pcDNA3.1-BMP-2质粒。在扩大培养的第7、14、21、28和35天时收集细胞，用相应试剂盒对细胞ALP活性和钙含量进行测定，在扩大培养的第21天采用RT-PCR检测细胞BMP-2 mRNA的表达水平。以未转染细胞作对照。结果转染组细胞BMP-2 mRNA相对表达水平为(1.652±0.082)，对照组为(0.473±0.021)，转染组BMSCs中BMP-2 mRNA的表达明显提高(t=2.192,P=0.005)。转染组细胞内ALP活性和钙含量较对照明显提高(P<0.01)。结论转染BMP-2基因的BMSCs表现出明显的成骨活性，可以应用为骨组织工程研究的种子细胞。

细胞移植治疗是近年来组织工程学研究的热点。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)有多向分化潜能，已大量应用于肌肉、软骨等组织工程。骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)是目前发现的最重要的新骨形成调控因子，具有诱导新骨形成的作用[1]。国内外大量研究[2]表明BMP-2与BMSCs在新骨生成过程中发挥协同作用。该研究中，作者构建了BMP-2基因转染的BMSCs，检测转染细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphalase,ALP)活性和钙含量，分析BMP-2基因转染对BMSCs成骨活性的影响。

1 材料与方法

1.1材料16只成年新西兰大耳白兔，雌雄不限，兔龄4～6周，体重0.5～1.5 kg。pcDNA3.1-BMP-2质粒由郑州大学基础医学院实验中心构建。倒置相差显微镜(德国Leica公司)，脂质体LipofectamineTM2000(美国Invitrgen公司)，胎牛血清、2.5 g/L胰蛋白酶溶液、DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，青、链霉素溶液(华北制药厂)，ALP活性检测试剂盒、细胞钙含量检测试剂盒和EDTA(广州东盛生物科技有限公司)。

1.2BMSCs的分离、培养及鉴定于兔髂后上嵴抽取骨髓组织，混合后种植于6孔细胞培养板内，加入DMEM培养基，反复吹打后加入地塞米松，振荡，培养3 d后更换DMEM培养基；当细胞长至培养孔面积的50%时，用胰蛋白酶处理，原孔传代2～3 d；当细胞长满培养孔后，吹打混匀，计数，接种于细胞培养瓶中传代培养；长满培养瓶后，用胰蛋白酶处理，配制细胞悬液，最后每50 μL细胞悬液复合于医用明胶海绵上，置于培养箱中孵育4 h备用[3]。取第2代细胞，利用免疫组化染色法检测BMSCs表面抗原标志物来进行鉴定[4]。取第3代细胞进行基因转染。

1.3pcDNA3.1-BMP-2的转染转染组：取BMSCs，以1×104mL-1的浓度接种，用DMEM培养基继续培养8 d后，收集细胞，调整细胞浓度为5×106mL-1备用。取1 mL细胞悬液，加适量EDTA，移入直径4 mm的电转杯中，加入12 μg pcDNA3.1-BMP-2质粒，简单吹打混匀后进行电转。电转参数：300 V，980 μF，二次脉冲，波形为方波/回旋波。在5 min内电击打并迅速冰浴，再加入37 ℃且含有体积分数15%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、含体积分数5% CO2孵箱中培养，24 h后电转，更换含有400 mg/L G418的DMEM培养基进行筛选培养3周[5]。对照组处理过程中不加入pcDNA3.1-BMP-2质粒，其余与转染组相同。两组筛选培养后均再扩大培养3周。实验重复5次。

1.4细胞BMP-2mRNA的检测扩大培养的第21天，以GAPDH基因作为内源性参照，采用RT-PCR法检测细胞BMP-2 mRNA，操作步骤参考ABI 7500 fast扩增仪和Premix Ex TaqTMTaqMan试剂盒说明书。引物序列见表1，所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增条件：92 ℃ 2 min；92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。用Image J灰度分析软件定量分析条带灰度值，以BMP-2与GAPDH条带灰度值的比值表示BMP-2 mRNA的相对表达水平。

表1 引物序列

1.5细胞中ALP活性和钙含量的测定在扩大培养的第7、14、21、28和35天时收集细胞，按照试剂盒说明书对ALP活性进行检测，于520 nm波长处测定吸光度(A)[6]；在扩大培养的第14、21、28和35天时收集细胞，按照细胞钙含量检测试剂盒说明书操作，于575 nm波长处测定A值[7]。

1.6统计学处理采用SPSS 10.0进行数据分析。两组细胞BMP-2 mRNA相对表达水平的比较采用两独立样本t检验，两组细胞ALP活性及钙含量的比较采用析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1BMSCs的生长情况在显微镜下，新鲜细胞呈“满天星”样，无法辨认细胞核。传代过程中，经胰蛋白酶消化后，细胞间隙增大，形态变圆并逐渐由圆形变为均一的长梭形；密度较高时，细胞呈漩涡状或放射状排列；细胞的贴壁率较高，传代4 h后即可出现贴壁现象，快速增殖3～4 d后细胞即可进行再次传代；传代培养的细胞外形更均一。第2、3代细胞增殖旺盛。第2代细胞经鉴定确认为BMSCs，见图1。

图1 培养成功的BMSCs(倒置相差显微镜,×100)

2.2细胞转染结果转染组BMSCs的形态见图2。RT-PCR检测结果显示，转染组细胞BMP-2 mRNA相对表达水平为(1.652±0.082)，对照组为(0.473±0.021)，转染组BMSCs中BMP-2 mRNA高效表达(t=2.192,P=0.005)。

图2 成功转染pcDNA3.1-BMP-2的BMSCs(倒置相差显微镜，×100)

2.3两组细胞ALP活性及钙含量的比较见表1、2。

表1 两组ALP活性的比较

F组间=2 269.808，P<0.001;F时间=588.941，P=0.003;F交互=104.167，P=0.004。

表2 两组钙含量的比较

F组间=1 703.214，P<0.001;F时间=292.348，P=0.003;F交互=4 431.468，P<0.001。

3 讨论

BMPs是目前最重要的新骨形成调控因子，具有诱导新骨形成的作用，主要由成骨细胞和瘤性成骨细胞分泌，在体内分布不多，主要分布于骨胶原纤维、骨膜、骨髓基质中，皮质骨的含量较松质骨多[8-9]。BMPs是骨形成过程中惟一能独立诱导间充质干细胞分化为骨细胞的调控因子[10]。研究[11]表明，低浓度的BMPs可诱导间充质干细胞移行至骨组织形成部位；中等浓度的BMPs能促进间充质干细胞分化为成软骨细胞及成骨细胞；高浓度的BMPs则可促进间充质干细胞增生。天然BMPs的获得或纯化均非常困难，目前通常采用基因重组技术大量制备rhBMP-2，rhBMP-2也被证实无论是正位还是异位均能诱导新生骨组织形成，这为临床应用BMP-2治疗骨缺损等提供了充足的物质基础[12-13]。

在临床上， BMSCs取自于骨髓，手术操作简便，来源较充足。BMSCs可以在短期之内以惊人的速度增殖，能使原始细胞数量在两三周内成千倍的增长，并且免疫原性很低[14]。BMSCs是多种类型的再生医学研究中首选的种子细胞，已经显示出巨大的临床应用前景。

国内外大量研究[15-16]表明，BMP-2与BMSCs在新骨生成过程中具有协同作用，通过在BMSCs中导入BMP-2基因并成功表达可以促进新骨再生。该实验中，作者成功将BMP-2基因转染入BMSCs，而且转染的BMSCs成功表达BMP-2 mRNA。培养3～4 d后，转染细胞的形态发生显著变化，由梭形逐渐变化为多角形，有的则转为肥硕梭形，成骨分化趋势显著。转染的BMSCs中ALP活性和钙含量较未转染细胞明显增强，进一步说明BMP-2基因转染在体外可诱导BMSCs向成骨方向分化。该结果为进一步基因治疗研究奠定了基础。

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(2013-01-17 收稿 责任编辑 王 曼)

Effect of BMP-2 gene transfection on alkaline phosphalase activity and calcium deposition in bone marrow mesenchymal stem cell of rabbits

ZHANGYanru1,2),ZHANGHui3),MAHui4),WANGYisheng2)

1)CenterofMedicalExperiment,InternationalEducationSchool,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

2)DepartmentofOrthopaedics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

3)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 4)DepartmentofOrthopaedics,theThirdPeople’sHospitalofLuoyangCity,Luoyang471002

bone morphogenetic protein 2; bone marrow mesenchymal stem cell; alkaline phosphalase; calcium; rabbit

Aim: To investigate the changes of alkaline phosphalase(ALP) activity and calcium deposition of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) transfected with BMP-2 gene. Methods: The bone marrow were extracted from posterior superior iliac spine of 16 adult rabbits,and mixed to be cultured.BMSCs were obtained and transfected with pcDNA3.1-BMP-2.At the 7th,14th,21st,28th and 35th day during the amplification culture,ALP activity and calcium deposition were detected;at the 21st day, BMP-2 mRNA was detected using RT-PCR. The BMSCs without transfection were the control.Results: The expression of BMP-2 mRNA was (1.652±0.082) in transfected BMSCs, and (0.473±0.021) in the control BMSCs,and the difference between them was significant(t=2.192,P=0.005). ALP activity and calcium deposition of transfected cells were higher than those of the control(P<0.01).Conclusion: BMSCs transfected with BMP-2 gene show obvious osteogenic activity,and could be used as seed cells for bone engineering research.

R681

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.029