肾炎宁对IgA肾病大鼠肾脏转化生长因子Smad2信号传导系统的影响

梁建英 陈欣华 苏白玉 寇立巧 高艳 郭登洲

·论著·

肾炎宁对IgA肾病大鼠肾脏转化生长因子Smad2信号传导系统的影响

梁建英 陈欣华 苏白玉 寇立巧 高艳 郭登洲

目的观察肾炎宁对IgA肾病(IgAN)大鼠肾脏病理学改变的影响，以探讨该方剂针对IgAN的治疗效果以及作用和机制。方法将30只健康雄性SD大鼠，适应性喂养1周后按重量(g)随机分为3个组，每组分为10只，分别分为正常组、模型组和肾炎宁组。除正常组外其余2组均给予隔日1次口服0.1%牛血清白蛋白(BSA)酸化水共6周，在第7周开始后每周连续给3 d尾静脉注射BSA缓冲溶液，共连续给6周，并于第8周末追加注射葡萄球菌肠毒素B(SEB)，每周只给1次，共给连续3周后以复制IgAN实验模型，正常组大鼠口服及注射均等量0.9%氯化钠注射液。于第9周末开始对肾炎宁组给予肾炎宁煎剂灌胃服用，正常组组、模型组均灌服等量0.9%氯化钠注射液，总共给药8周。并分别于造模型前、造模型后第6个周末、8个周末、12个周末、第16个周末用代谢笼收集24 h的尿液，并进行24 h的尿蛋白定量测定。于16周末处死实验大鼠，股动脉取血样，留取实验大鼠肾脏组织，在光镜观察大鼠肾小球的变化，免疫荧光观察IgA沉积情况，免疫组化及聚合酶链反应(PCR)对肾组织中Smad2进行半定量分析。结果与正常组比较，模型组和肾炎宁组阳性增强的核占小球细胞的百分比值显示显著增加(P<0.05)，与模型组比较，肾炎宁组的表达情况明显低下(P<0.05)。RT-PCR结果可以显示：与正常组相比较，模型组和肾炎宁组Smad2mRNA的值显著增加(P<0.05)，与模型组比较，肾炎宁表达情况明显降低(P<0.05)。结论肾炎宁能够抑制受体活化性蛋白smad2的表达，从而抑制IgAN大鼠肾脏中smad2信号传导通路的激活，减少大鼠肾脏ECM沉积，延缓IgAN的进程。

IgA肾病；肾炎宁；动物实验；肾脏转化生长因；smad2信号传导系统

IgA肾病又称Berger病，是指肾小球系膜区以IgA或IgA沉积为主的一种原发性肾小球肾炎，临床上典型表现有血尿，伴有或不伴有蛋白尿，是我国较为常见的肾小球疾病之一，也是终末期肾衰的主要原因之一[1，2]。严重危害人们的身体健康，目前认为IgA肾病是导致肾纤维化的主要因素。多数学者认为多种细胞因子[如白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等]参与了本病的发病过程，它们直接或间接导致肾小球系膜外基质的沉积，加速了肾小球的硬化。本研究通过肾炎宁对大鼠肾组织肾脏病理学改变的影响，探讨其对肾脏的保护机制为有效的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康的雄性大鼠共30只，清洁等级，重量(130±10)g，实验所用动物由河北医科大学动物实验中心提供饲养环境30只大鼠置于安静的空调房内饲养，室温保持在18～23℃，相对湿度保持在45%～55%，分装到6只饲养笼中，每日更换垫料，开窗通风。适应性喂养实验动物1周以后用代谢笼留取大鼠的尿液，并用试纸条来检测尿蛋白、尿潜血均为阴性者入组，并根据大鼠的体重(g)给予排序，随机分为3个组：正常组、模型组、肾炎宁组，每组10只。

1.2 实验药物和受试药物 中药(黄芪、生地黄、仙鹤草、党参、白术、白茅根、茯苓、墨旱莲、川芎、女贞子、三七粉、甘草)，均由河北省中医院中药房提供，实验药物用水煎浓缩至含生药3.9 g/ml，放置于瓶中密封4℃存放以备应用，18.7 g·kg-1·d-1灌胃。

1.3 主要实验试剂与实验仪器 牛血清白蛋白SBA是由美国Sigma公司提供的。葡萄球菌肠毒素SEB是由中国军事科学研究院微生物流行病研究所给予提供。DEPC是由美国Amresco公司给予提供。Trizol是由北京索莱宝生物科技有限公司给予提供。异丙醇是由天津市博迪化工有限公司提供。琼脂糖由上海GENE生物有限公司提供。匀浆器(JJ-1型定时电动搅拌器 )是由国华仪器厂给予提供。Sartorius是由电子天平北京赛多利斯天平有限公司给予提供。水平电泳槽、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪均由北京市六一仪器厂提供。医学图像定量分析系统由武汉千屏影像技术有限责任公司提供等

1.4 模型制备 新鲜的双蒸水中加入盐酸,浓度为8.5 mmol/L。即1 000 ml双蒸水中加入10%盐酸3.2 ml。1% BSA酸化水的制备,1 g BSA加入1 000 ml酸化水。4℃保存以备使用。1% BSA缓冲溶液的制备是将1 g BSA溶于100 ml的0.9%氯化钠注射液中。必须是现用现配。造模方法是依据文献的方法[1],除正常对照组小鼠自由饮食水外，其余2组均在其基础上隔日口服含0.1% BSA的酸化水6周,6周后按10 mg/kg每日1次定期尾静脉注射1%BSA缓冲液,每周连续3 d，于第8周按0.4 mg/kg,每周1次,连续3周,复加尾静脉注射SEB。正常组口服及注射同等量0.9%氯化钠溶液，于16周末处死动物。

1.5 给药方法 于造模第9周开始给药，1次/d，肾炎宁组给予中药煎剂18.7 g/kg、d灌胃，正常组和模型组给予相当剂量的0.9%氯化钠注射液灌胃，3组总共给药8周。

1.6 观察指标及方法 分别于造模型前及造模型后的第6个周末，第8个周末，第12个周末，第16个周末将大鼠放置于代谢笼当中，一定要禁食，但让其自由饮水。造模后第16周末处死大鼠，股动脉取血，分离血清，全部大鼠给药第8周末处死大鼠，分离出肾脏，0.9%氯化钠溶液冲洗，留取需要的组织块。

2 结果

2.1 3组一般情况 正常组大鼠饮食正常，其余两组在口服BAS缓冲液期间饮食、外观都与正常组大鼠无差别。尾静脉注射BAS后，2组大鼠出现倦怠，嗜睡，食欲减退等症状，3 d后上述症状好转。尾静脉注射SEB后，模型组大鼠精神萎靡，少动抱团，1周以后症状改善。

2.2 大鼠肾脏组织Smad2蛋白以及其基因方面表达的影响 免疫组化染色分析显示：与正常实验组相比较，模型实验组和肾炎宁实验组阳性增强的核占小球细胞的百分比值显著增加(P<0.05)，与模型实验组相比较，肾炎宁实验组的表达明显有所降低(P<0.05)。RT-PCR结果分析显示：与正常实验组相比较，模型实验组和肾炎宁实验组Smad2mRNA显著增加(P<0.05)，与模型实验组相比较，肾炎宁实验组的表达数值明显降低(P<0.05)。见表1，图1。

3 讨论

IgA肾病是一组临床很常见的肾小球疾病，其发病机制尚未完全阐明，其中免疫病理学显示在肾小球的系膜区有IgA或以IgA为主的颗粒样物质沉积,临床表现以血尿为主，伴或不伴有蛋白尿，是导致慢性肾功能衰竭的一个很重要的原因[3]。

西医认为IgA的发病机制很复杂。发病机制尚不明确，大多数学者认为因本病属于免疫复合物介导的肾小球肾炎，因此免疫反应在本病的发病中起主要作用[4-6]。IgA分子有IgA1和IgA2两种亚型，其中沉积于IgA肾病肾小球系膜区的为多聚IgA1(PIgA)。IgA1分子包含一个高度糖基化的铰链区，这个铰链区是由一段18个氨基酸残基组成的肽链。它具有高度糖基化，在对IgA分子构型的研究上发现,IgA1分子至少含有6个O-型糖基位点。因此认为,IgAN患者血清中IgA1铰链区糖基化发生了改变致使IgA1的O-糖链末端半乳糖缺失是造成肾系膜沉积的重要原因，IgA1链区核心1-β,3半乳糖基转移酶的活性下降而致O-糖链末端半乳糖缺乏丢失,从而暴露出次末端的GalNac,并对暴露出糖基上新的抗原决定簇[4]，使机体识别后新产生的抗原决定簇病形成与之具有特异性的抗体，二者相结合产生抗原抗体复合物，最终沉积在肾脏的系膜区。这种异常糖基化的IgA1失去了与肝细胞膜上特异性受体结合的能力,不能被肝细胞识别和清除，聚合成PIgA沉积在肾小球系膜区[7-11]。

表1 3组Smad2水平比较

组别Smad2正常组11.29±2.07模型组47.21±5.57*肾炎宁组30.88±6.13*#

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

正常组 模型组 肾炎宁组

细胞因子在本病的进展中起到一定的作用，例如白介素(IL-1、IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)等都通过各种途径参与并刺激肾小球系膜上细胞的增殖。并导致细胞外基质在肾小球和肾小管中大量堆积，使肾小球发生硬化、肾间质纤维化形成，以致于最终导致肾功能衰竭[8]。

历代医家在其著作里都曾对本病的发病原因进行阐述：《素问·气厥论》谓:“胞移热于膀胱,则癃溺血”，提出了本病的病因为膀胱有热；《金匮要略》指出:“热在下焦者则尿血”，首次提出了“尿血”的病名；《痿论》中指出:“悲哀太甚则胞络绝也,胞络绝则阴气内动也,发则心下崩,数溲血也”。《诸病源候论》中也有学者认为:“劳损于肾,动伤经络,又为风冷所侵,血气击搏,故腰痛是也”。血尿多与热有关，血尿的病机与热、虚、瘀、外感风热之邪侵袭人体有关；思虑劳倦过度，损伤脾胃，致使气血失和，湿热内聚，热伤血络，热迫血妄行，则发病；肾阴亏则虚也，阴虚则内热也，灼伤血络而导致尿血，而出血又多伴有瘀滞，瘀血阻滞经络，则血不循经，故血尿不止；此外邪热下扰肾络，则往往使血尿加重或反复[12，13]。张永鹏等[6]通过对IgA肾病中医辨证规律的研究,发现本病的病机多呈从阴虚到气阴两虚再到阴阳两虚的过程，而且常因外感、湿热、劳累、饮食不当等诱因而诱发,使病情进一步加重。

以“益气养阴、活血通络”为大法的肾炎宁能改善IgA大鼠的一般情况，能够抑制受体活化性蛋白smad2的表达，从而抑制IgA大鼠肾脏中smad2信号传导通路的激活，减少大鼠肾脏ECM沉积，延缓IgA的进程，进而缓解肾脏损伤。

1 Tarelli E,Smith AC,Hendry BM,et al.Human serum IgA1 is substituted with up to six O-glycans as shown by matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry.Carbohydr Res,2004,339:2329-2335.

2 Tarelli E,Smith AC,Hendry BM,et al.Human serum IgA1 is substituted with up to six O-glycans as shown by matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry.Carbohydr Res,2004,339:2329-2335.

3 谢院生,陈香美.扁桃体与IgA肾病的发病和治疗.中华肾脏病杂志,2004,20: 300-302.

4 史胜平,周武斌.黄芪治疗小鼠巨细胞病毒性肝炎的实验研究.中国现代实用医学杂志，2007，6：7-8.

5 Zhang M，Chiu LC，Cheung PC,et al.Growth-inhibitory effects of a heta-glucan from themycelium ofPoria cocos on human breast carcinomaMCF-7 cells: cell-cycle arrest and apoptosis induction.Oncol Rep，2006，15: 637-643.

6 张永鹏,申宝娜,刘宏伟.中医药治疗IgA肾病探析.河南中医,2000,20:28-29

7 余凌,李惊子,王海燕.黄芪当归在肾脏疾病中的应用及其机制研究进展.中国中西医结合杂志,2001,21:396.

8 于江月,李树青.黄芪对自发性高血压大鼠早期肾组织NO和NOS的影响.心脏杂志,2007,19:406-420.

9 林可意,曾龙驿.转化生长因子-β在糖尿病肾病发生中的作用.国际内科学杂志,2007,34:379

10 Lee WS，Yang HY，Kao PF，et al.Tetramethylpyrazine downregulates angiotensin II-induced endothelin-1 gene expression in vascular endothelial cells.Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2005，32：845-850.

11 焦坤,陈佩东.白茅根研究概括.江苏中医药,2008,40: 91-93.

12 杨立鹏.肾炎宁治疗非肾病综合征IgA肾病的档分析.中外医学研究，2012，10：16-17.

13 郭登洲，边东，王月华，等.肾炎宁治疗非肾病综合征IgA肾病的疗效观察.中国中西医结合杂志，2010，29：841-844.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.007

050011 河北省石家庄市第一医院干部科(梁建英)，心内科(陈欣华)，内分泌科(苏白玉)；河北省石家庄市第二医院病案科(寇立巧)；唐山职业技术学院(高艳)；河北省中医院(郭登洲)

R 692.6

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1002-7386(2014)15-2261-03

2014-01-22)