通心络胶囊抑制NF-κB通路抑制糖尿病视网膜病变小鼠黏附分子的作用

王超 邢邯英 王杏 刘敏 张哲

·论著·

通心络胶囊抑制NF-κB通路抑制糖尿病视网膜病变小鼠黏附分子的作用

王超 邢邯英 王杏 刘敏 张哲

目的观察通心络胶囊抑制NF-κB通路抑制糖尿病视网膜病变小鼠黏附分子的作用。方法KK/Upj-Ay小鼠随机分为模型组、通心络高、中、低(生药4、2、1 g/kg)剂量组，另设C57BL/6小鼠对照组。灌胃给药3个月，测定血-视网膜屏障功能；流式测定血液中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)含量；Real Time PCR(qPCR)和Western blot法测定视网膜ICAM-1、VCAM-1和核因子-κB(NF-κB)表达。结果通心络中、高剂组EB含量比模型组明显下降(P<0.01)；通心络中、高剂组血清ICAM-1、VCAM-1含量显著下降(P<0.05)；通心络组ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表达均显著下降(P<0.01)；通心络中、高组核NF-κB表达显著下降(P<0.05)；总NF-κB mRNA及蛋白表达在各组差异无统计学意义(P>0.05)。结论通心络胶囊可抑制NF-κB通路抑制糖尿病视网膜病变小鼠黏附分子，改善糖尿病视网膜病变。

通心络胶囊；糖尿病视网膜病变；黏附分子；NF-κB通路

糖尿病视网膜病变(DR)是一种具有特异性改变的眼底病变，是临床糖尿病患者失明的主要原因，每年呈上升趋势，但并无确切疗效的药物上市[1]。DR 发生机制复杂，持续性高糖、血液-视网膜屏障受损、炎性反应等各种因素均会引起DR的发生[2]。在DR发生早期，在黏附分子介导下，白细胞黏附于视网膜血管，引起内皮细胞受损，导致血液-视网膜屏障被破坏，从而引发了DR发生[3]。文献报道通心络能改善血管内皮功能，治疗DR[4]，但其具体机制尚不明确。本实验采用自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠为DR模型，观察通心络胶囊对KK/Upj-Ay小鼠黏附分子的影响，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠，12周龄，雄性，30～40 g；C57BL/6小鼠，雄性，25～30 g，购于北京华阜康生物科技公司，生产许可证号：SCXK-(京)2009-0002。

1.1.2 药物、试剂与仪器：通心络胶囊购于石家庄以岭药业；细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)引物、核因子-κB(NF-κB)由上海生工生物技术公司合成；ICAM-1、VCAM-1和NF-κB一抗购自abcam公司。7300 Real-Time PCR System仪，购于ABI公司；Biorad凝胶成像分析仪，购于Biorad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠分组：按KK/Upj-Ay空腹血糖值(FBG)分为模型组、通心络高剂组、通心络中剂组、通心络低剂组，另设C57BL/6小鼠为对照组，每组10只。每组小鼠灌胃给药，通心络高剂组、通心络中剂组、通心络低剂组分别给予生药4、2、1 g/kg的通心络胶囊，模型组和对照组灌胃等体积的蒸馏水，1次/d，自由饮食饮水，连续3个月。

1.2.2 FBG测定：实验结束后眼球取血，测定FBG。

1.2.3 血-视网膜屏障的测定：给药结束，每组取其中6只小鼠尾静脉注射50 mg/kg伊文思蓝(EB)溶液，2 h后小鼠麻醉，灌注4%多聚甲醛缓冲液，灌注压力80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，灌注4 min后摘除眼球，分离视网膜，称量。将视网膜放入150 μl甲酰胺，37℃孵育12 h，3 000 r/min离心10 min，取上清置96孔酶标板，620 nm处测定OD值。EB浓度结果表示为ng/mg。

1.2.4 流式检测小鼠全血中ICAM-1、VCAM-1的含量：取小鼠全血，分离外周血单个核细胞，加入PMA和离子霉素刺激淋巴细胞，应用流式细胞仪检测细胞，Exp32软件获取分析细胞，每个检测获取10 000个细胞，分析ICAM-1、VCAM-1的表达。

1.2.5 Real Time PCR方法测定小鼠视网膜ICAM-1、VCAM-1和NF-κB mRNA的表达：取小鼠视网膜，常规方法提取组织RNA，鉴定，按试剂盒说明书进行Real Time PCR扩增，以GAPDH作为内参照。ICAM-1引物：上游：5’- TTCCGCTACCATCACCGTGT -3’，下游：5’- AGGTCCTTGCCTACTTGCTG -3’，产物片段84 bp；VCAM-1引物：上游：5’-GGGAGACCTGTCACTGTCAACT-3’，下游：5’-GGACTTTATGCCCATTTCCTC-3’，产物片段129 bp；GAPDH引物：上游：5’-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’，下游：5’-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3’，产物片段143 bp。用仪器自带软件分析，将对照组设置为1，以对照组进行比较后的相对定量值为目的基因表达。

1.2.6 Western blot法检测小鼠视网膜ICAM-1、VCAM-1和NF-κB蛋白的表达：取小鼠视网膜，加裂解液提取视网膜组织总蛋白或核蛋白，加入稀释合适浓度的TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1抗体，化学发光法显色。以β-actin作为内参，扫描后对条带进行吸光度积分分析，以目的蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值为目的蛋白表达。

2 结果

2.1 5组小鼠FBG的变化 与对照组比较，模型组小鼠FBG值明显升高(P<0.01)，通心络给药后12周FBG与模型组有下降的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 5组小鼠FBG的变化

组别 FBG药前第12周对照组5.3±0.85.5±0.9模型组14.8±2.7*17.5±2.8*通心络低剂组14.7±2.816.5±2.4通心络中剂组14.6±2.615.8±1.9通心络高剂组14.9±2.315.0±2.3

注：与对照组比较，*P<0.01

2.2 5组EB含量的变化 与对照组比较，模型组EB含量明显升高(P<0.01)，通心络中、高剂组EB含量比模型组明显下降(P<0.01)。见表2。

表2 5组小鼠EB含量的变化

组别EB含量对照组12.6±2.6模型组25.5±3.6*通心络低剂组20.8±3.9通心络中剂组16.4±2.6#通心络高剂组16.1±2.4#

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

2.3 5组血液中ICAM-1、VCAM-1含量的变化 模型组ICAM-1、VCAM-1含量明显高于对照组(P<0.01)，与模型组比较，通心络中、高剂组ICAM-1、VCAM-1含量显著下降(P<0.05)。见表3。

表3 5组小鼠ICAM-1、VCAM-1含量的变化

组别ICAM-1VCAM-1对照组0.33±0.060.60±0.10模型组7.50±1.10*5.80±0.56*通心络低剂组6.97±0.714.30±0.50#通心络中剂组4.20±0.80#3.50±0.52#通心络高剂组3.20±0.66△3.43±0.35△

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01

2.4 5组视网膜ICAM-1、VCAM-1和NF-κB表达的变化 模型组ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表达明显高于对照组(P<0.01)，与模型组比较，通心络低、中、高剂组ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表达均显著下降(P<0.01)；模型组核NF-κB蛋白表达明显高于对照组(P<0.01)，与模型组比较，通心络中、高剂组核NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.05)；总NF-κB mRNA及蛋白表达在各组差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图1、2。

表4 5组小鼠视网膜ICAM-1、VCAM-1和NF-κBmRNA及蛋白表达的变化

组别 ICAM-1mRNA蛋白VCAM-1mRNA蛋白总NF-κBmRNA蛋白核NF-κB对照组1.18±0.210.23±0.041.07±0.140.27±0.040.99±0.090.62±0.070.21±0.03模型组4.14±0.33*0.79±0.07*6.93±0.59*1.09±0.18*1.08±0.130.70±0.090.61±0.07*通心络低剂组2.30±0.22△0.51±0.05△3.59±0.86△0.60±0.09△1.08±0.110.66±0.080.52±0.05通心络中剂组2.68±0.29△0.49±0.07△2.61±0.39△0.51±0.07△1.12±0.080.69±0.090.43±0.05#通心络高剂组2.64±0.51△0.44±0.04△1.80±0.26△0.42±0.06△1.09±0.190.64±0.070.34±0.04△

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，△P<0.01

图1 4组荧光定量PCR扩增曲线

图2 5组Western blot结果

3 讨论

KK/Upj-Ay为自发性2型糖尿病小鼠，24周龄的KK/Upj-Ay小鼠能观察到视网膜各层排列紊乱，出现空泡变性等明显的糖尿病视网膜病变特征[5]。研究表明，通心络胶囊灌胃3个月能明显改善DR小鼠血液-视网膜屏障功能，表明通心络胶囊对治疗DR有一定的作用。在本实验中，我们观察到通心络胶囊并没有有效的控制血糖，说明通心络对DR的作用是独立于降糖作用之外的其他机制。

文献报道了将正常和糖尿病视网膜病变的尸体眼进行研究，结果发现DR玻璃体内ICAM-1、VCAM-1的含量显著高于正常组(P<0.05)，并且与糖尿病类型及糖尿病病程无关[6]，在随后的实验研究中，也得到了一致的结论[7]。ICAM-1、VCAM-1是主要的黏附分子，同属于免疫球蛋白超家族。我们观察到KK/Upj-Ay血清中ICAM-1、VCAM-1含量显著升高，视网膜中ICAM-1、VCAM-1表达亦显著增高，提示了黏附分子在DR发生发展中起到重要作用。通心络胶囊能同时降低血清中的ICAM-1、VCAM-1含量和视网膜的表达，表明通心络改善DR的作用与抑制粘附分子ICAM-1、VCAM-1密切相关。

NF-κB途径是黏附分子参与DR的发病主要机制之一。高糖、缺氧等均能激活NF-κB，活化的NF-JB可上调黏附分子的表达，使白细胞淤滞、黏附于视网膜血管，引起一系列视网膜病变。我们结果显示核NF-κB水平在DR小鼠中显著升高，通心络能抑制核NF-κB表达，表明通心络抑制黏附分子的高表达是通过NF-κB途径实现的。

随着对黏附分子的深入研究，人们逐步认识到黏附分子与DR关系密切。对其表达调控、信号途径等做深入探讨，对提高DR治疗有重要临床意义。对中药在DR治疗上黏附分子的研究，也将为DR治疗提供重要的理论基础。

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3 沈玺,徐格致.粘附分子在糖尿病视网膜病变的研究进展.国外医学眼科学分册,2005,29:259-263.

4 朱丹,都丹,李丹梅,等.通心络治疗2型糖尿病视网膜病变患者临床疗效观察.络病学基础与临床研究,2006,220-222.

5 张会欣,朱慧明,魏刚,等.芪黄明目胶囊对糖尿病小鼠视网膜粘附分子的作用及其机制.时珍国医国药,2012,23:1872-1878.

6 Miyamoto K,Khosrof S,Bursell SE.Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96:10836-10841.

7 Ugurlu N,Gerceker S,Yülek F,et al.The levels of the circulating cellular adhesion molecules?ICAM-1,VCAM-1 and endothelin-1 and the flow-mediated vasodilatation values in patients with type 1diabetes mellitus with early-stage diabetic retinopathy.Intern Med,2013,52:2173-2178.

TheinhibitoryeffectofTongxinluocapsuleonadhesionmoleculesinmicewithdiabeticretinopathythroughinhibitingNF-κBpathway

WANGChao,XINGHanying,WANGXing,etal.DepartmentofGerontology,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effect of Tongxinluo capsule on adhesion molecules in mice with diabetic retinopathy through inhibiting NF-κB pathway.MethodsKK/Upj-Ay mice were randomly divided into model group,Tongxinluo (low-dose,median-dose,high-dose) groups.C57BL/6 mice were selected as control group.The mice were given Tongxinluo intragastrically for 3 months.Then the retina barrier function was detected,and contents of ICAM-1,VCAM-1 were determined by flow cytometry.The expression levels of ICAM-1,VCAM-1 and NF-κB in retina were detected by Real Time PCR (qPCR) and Western Blot.ResultsThe contents of EB in Tongxinluo median-dose and high-dose groups were obviously decreased (P<0.01);the serum levels of ICAM-1 and VCAM-1in Tongxinluo median-dose and high-dose groups were significantly decreased (P<0.05);the expression levels of ICAM-1,VCAM-1 mRNA and protein in Tongxinluo groups were obviously decreased (P<0.01);expression levels of NF-κB in Tongxinluo median-dose and high-dose groups were obviously decreased (P<0.05),however,there were no significant differences in the expression levels of total NF-κB mRNA and protein among groups (P>0.05).ConclusionTongxinluo capsule can inhibit adhesion molecules in mice with diabetic retinopathy mice through inhibiting NF-κB pathway,as a result,which can improve diabetic retinopathy.

Tongxinluo capsule;diabetic retinopathy;adhesion molecules;NF-κB pathway

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.001

项目来源：国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(编号：2012CB518606)

050051 石家庄市，河北省人民医院老年医学重点实验室

R 587.2

A

1002-7386(2014)15-2245-03

2014-02-10)