津力达对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表达的影响

臧莎莎 刘颐轩 宋光耀 王超

·论著·

津力达对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表达的影响

臧莎莎 刘颐轩 宋光耀 王超

目的探讨津力达对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表达的影响。方法SD大鼠分为正常对照组(ND组),高脂对照组(HFD组),津力达组及吡格列酮组，每组6只;灌胃8周后,进行腹腔注射葡萄糖耐量试验并计算曲线下面积(AUC);测得大鼠空腹血糖、胰岛素计算HOMA-IR指数;RT-PCR及western-blotting检测大鼠骨骼肌GLUT4表达。结果津力达明显改善了30 min、60 min血糖及AUC,吡格列酮改善了60、120 min血糖及AUC(P<0.05);津力达及吡格列酮明显改善HOMA-IR指数(P<0.05);津力达及吡格列酮明显上调了骨骼肌GLUT4的表达。结论津力达能够上调大鼠骨骼肌GLUT4的表达,改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。

津力达;胰岛素抵抗;骨骼肌;GLUT4

胰岛素抵抗是2型糖尿病的病理基础[1]。骨骼肌是一关键的代谢组织,能够处置餐后70%～90%葡萄糖,骨骼肌胰岛素抵抗的发生对全身胰岛素的敏感性产生重要影响[2]。骨骼肌组织中的葡萄糖转运子4(GLUT4)是胰岛素作用下的主要葡萄糖运载体。高脂饮食诱导的胰岛素抵抗的发生常伴随胰岛素刺激下GLUT4表达及转位的异常。中成药津力达主要用于胰岛素抵抗及2型糖尿病的治疗,但其分子机制尚未明确。本实验主要观察津力达对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表达的影响,进一步明确其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 津力达中成药由河北以岭药业提供;盐酸吡格列酮片,规格15 mg/片,由日本武田制药有限公司生产;GLUT4抗体购于Signalway公司,β-actin抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自ProteinTech Group公司;ECL化学发光试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 实验动物 清洁级雄性SD大鼠36只，体重(140±20)g均购自北京维通利华有限责任公司,许可证号：slxk(京)7009-0017。

1.3 实验饲料 基础饲料购自河北医科大学实验动物中心,热量组成:碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白质24.2%，总热量为348 kcal/100 g;自制高脂饲料热量组成:碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白质占20.1%，总热量为501 kcal/100 g。

1.4 方法

1.4.1 动物分组:36只雄性SD大鼠随机分为2组:12只予基础饲料喂养,24只予高脂喂养。6周后每组各取6只行正葡萄糖高胰岛素钳夹实验判断IR模型造模成功。基础饲料喂养的剩余6只继续予基础饲料作为正常对照组(ND组);高脂喂养造模成功的18只进一步分组:高脂对照组(HFD组),吡格列酮治疗组给予4.5 mg·kg-1·d-1,津力达治疗组给予1.5 g·kg-1·d-1,吡格列酮与津力达溶液用0.5%的羟甲基纤维素钠配置。灌胃给药1次/d,正常、高脂对照组予同体积0.9%氯化钠溶液灌胃,每周测量体重及统计摄食量。灌胃第8周,腹主动脉放血处死大鼠,留取血清;留取股四头肌标本，-80℃保存备用。

1.4.2 高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验:60 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，行右颈动脉、右颈静脉插管术，导管经皮下由耳后引出并固定，用100 U/ml肝素封管，结扎固定于颈后皮肤。插管术后3～5 d，待大鼠恢复体重，禁食12 h过夜，次日在特制的鼠笼中行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验。测定基础血糖值后，以4 mU·kg-1·min-1匀速输注胰岛素,使大鼠体内的胰岛素水平迅速升高。其后每10分钟测定1次静脉血糖，输注并调整30%葡萄糖溶液的输注率，使维持血糖在(5.0±0.5)mmol/L，连续3次以上血糖在上述范围即表明达到稳态，取稳态下5～6次葡萄糖输注率(GIR)的平均值作为大鼠胰岛素敏感性的评价指标[3]。

1.4.3 腹腔注射葡萄糖耐量实验:首先尾静脉放血测得大鼠空腹血糖,然后腹腔注射50%的葡萄糖(2 g/kg),注射后用快速血糖测定仪测定5、10、30、60、120 min的血糖,并计算葡萄糖曲线下面积(AUC)。

1.4.4 计算HOMA-IR:测得大鼠空腹血糖与胰岛素,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5[4]。

1.4.5 RT-PCR检测：用Trizol法提取小鼠骨骼肌总RNA,RT-PCR采用Syber Green I GoTaq qPCR Master Mix试剂盒在ABI PRISM 7300 PCR 仪上进行。反应条件:95℃预变性10 min，随后95℃变性15 s 40个循环，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。GLUT4上游引物5’-ATACTCATTCTCGGACGGTTC-3’,下游引物5’-CCCACATACATAGGCACCAA-3’;β-actin上游引物5’-TGTGATGGTGGGTATGGGT-3’,下游引物5’-AGGATGCCTCTCTTGCTCTG-3’。反应结束后，按照各反应孔Ct值,以β-actin 基因为内参，根据公式2-△Ct计算各样品目的基因相对表达量。

1.4.6 骨骼肌GLUT4蛋白表达：采用 Western-blotting方法测定。冷冻的骨骼肌组织称质量，加入组织裂解液提取蛋白并定量。取30 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转移至聚偏氟乙烯 (PVDF)膜，封闭液室温封闭4 h,GLUT4、β-actin一抗4℃摇床过夜,洗膜后再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗,室温孵育2 h,用ECL化学发光试剂盒暗室显影。

2 结果

2.1 腹腔注射葡萄糖耐量实验 与ND组相比，HFD组0、5、30、60、120 min血糖及AUC明显升高(P<0.05)。津力达组30、 60血糖及AUC较HFD组降低(P<0.05)，较ND组升高(P<0.05)；吡格列酮组60、120 min及AUC较HFD组降低(P<0.05)，较ND组升高(P<0.05)。见表1。

2.2 HOMA-IR 与ND组相比，HFD组HOMA-IR指数明显升高(P<0.05)；津力达及吡格列酮组HOMA-IR指数较ND组升高，较HFD组降低(P<0.05)。见表1。

表1 4组血糖和AUC及HOMA-IR比较

项目ND组HFD组津力达组吡格列酮组血糖(mmol/L) 0min4.60±0.326.60±0.52*5.73±0.385.97±0.38 5min9.63±0.4712.33±0.55*10.20±0.679.67±0.60 10min12.80±1.3216.70±0.8511.83±1.4413.57±0.55 30min9.70±0.2117.10±0.21*15.30±0.61*15.47±0.75* 60min7.07±0.4114.47±0.81*10.13±0.38*#9.67±0.52*# 120min5.43±0.098.17±0.15*6.10±0.26#6.40±0.21#AUC15.72±0.5026.84±0.63*20.58±0.91*#20.78±0.55*#HOMA-IR2.27±0.228.70±0.39*3.88±0.38*#3.52±0.34*#

注：与ND组比较，*P<0.05；与HFD组比较，#P<0.05

2.3 大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA及蛋白的表达 骨骼肌GLUT4 mRNA及蛋白表达HFD组低于ND组(P<0.05)，津力达及吡格列酮组较HFD组mRNA及蛋白表达升高(P<0.05)。见图1。

图1 不同组间GLUT4蛋白及mRNA表达的比较

3 讨论

随着生活方式的改变,糖尿病的发病率日益增加。中医药作为祖国传统医学在医学体系中占据重要地位，近年来一些中成药的降糖效果得到了人们的认可,在糖尿病治疗方面取得了一定成果。本课题研究的主要内容是降糖药物津力达,它是一种中成药,由人参、黄精、苍术(炒)、苦参、麦冬、地黄等十几味中药制成,但其具体的降糖机制尚不明确。

胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)主要表现为胰岛素对其靶组织的生理效应降低，胰岛素介导下骨骼肌、脂肪组织对葡萄糖的摄取、利用或储存的效力减弱[3]。骨骼肌是胰岛素刺激葡萄糖利用的主要组织,因而也是IR的主要部位。骨骼肌IR的发生对于全身IR的发生发挥重要作用[4]。

葡萄糖转运子4(GLUT4)是一种糖蛋白,主要存在于胰岛素敏感组织如骨骼肌、心肌和脂肪细胞中,直接参与细胞对葡萄糖的摄取和转运[5]。GLUT4是骨骼肌细胞利用葡萄糖的主要限速步骤,其表达减少或转运障碍直接导致骨骼肌对葡萄糖的摄取障碍,进而导致高血糖[6]。未受到刺激时90% GLUT4分布在细胞内:如微粒体、高尔基复合体、管型囊等囊泡样结构中,当肌肉收缩或受到胰岛素刺激后通过胰岛素受体-胰岛素受体底物1-磷脂酰肌醇3激酶-AKT/PKB等一系列信号转导通路使得GLUT4转位到细胞膜来摄取葡萄糖[7]。本研究中高脂饮食组与正常组比较,骨骼肌GLUT4 mRNA及蛋白的表达明显减低,因而摄取葡萄糖的能力减低,HOMA-IR升高,出现了胰岛素抵抗,津力达干预之后明显上调了骨骼肌GLUT4的表达,改善了HOMA-IR及曲线下面积AUC。

综上,本研究发现高脂饮食会诱导胰岛素抵抗的发生,伴随骨骼肌组织GLUT4表达的下调;津力达干预可以上调GLUT4的表达,增加葡萄糖的摄取,改善胰岛素抵抗,为津力达的临床应用提供了分子水平的理论支持。

1 Sinaiko AR,Caprio S.Insulin resistance.The Journal of Pediatrics,2012,161:11-15.

2 Pedersen BK,Febbraio MA.Muscles,exercise and obesity:skeletal muscle as a secretory organ.Nature reviews Endocrinology,2012,8:457-465.

3 高宇,宋光耀,王敬,等.高脂喂养及罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌脂肪酸转位酶表达的影响.中华老年医学杂志,2007,26:931-934.

4 李宝毅,谢云.HOMA评估法及其研究进展.中国糖尿病杂志,2008,16:126-128.

5 Leto D,Saltiel AR.Regulation of glucose transport by insulin:traffic control of GLUT4.Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13:383-396.

6 Kong D,Song G,Wang C,et al.Overexpression of mitofusin 2 improves translocation of glucose transporter 4 in skeletal muscle of highfat dietfed rats through AMPactivated protein kinase signaling.Mol Med Rep,2013,8:205-210.

7 刘传道,江钟立.GLUT4转位和活性的研究进展.中国康复医学杂志,2004,19:313-315.

EffectofJinlidaontheexpressionofGLUT4inskeletalmuscleofratswithinsulinresistance

ZANGShasha*,LIUYixuan*,SONGGuangyao,etal.*InstituteofPostgraduateStudentsofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

ObjectiveTo investigate the effect of Jinlida on the expression of GLUT4 in skeletal muscle of rats with insulin resistance.MethodsSprague Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups:normal diet group (ND group),high-fat diet group (HFD group),high fat diet with Jinlida group (Jinlida group) and high fat diet with pioglitazone group (pioglitazone group),with 6 rats in each group.After 8 weeks,intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed and area under the curve (AUC) was calculated based on the blood glucose curves;blood glucose and insulin were detected to calculate HOMA-IR;the expression levels of GLUT4 in skeletal muscle were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot.ResultsJinlida administration obviously improved 30min,60min blood glucose and AUC during IPGTT,pioglitazone improved significantly 60min,120min blood glucose and AUC (P<0.05),both Jinlida and pioglitazone improved obviously HOMA-IR index (P<0.05),and both of them up-regulated the expression of GLUT4 in skeletal muscle (P<0.05).ConclusionJinlida can up-regulate expression of GLUT4 in skeletal muscle of rats,as a result,which can improve insulin resistance induced by high fat diet.

Jinlida;insulin resistance;skeletal muscle;GLUT4

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.006

050017 石家庄市，河北医科大学研究生学院(臧莎莎、刘颐轩)；河北省人民医院(宋光耀、王超)

R 587.1

A

1002-7386(2014)15-2259-03

2014-01-14)