急性髓系白血病患者CXXC5基因表达水平及与预后的相关性

潘志兰 杨彦 张永梅 张志敏 冯丽倩 邢英杰

·论著·

急性髓系白血病患者CXXC5基因表达水平及与预后的相关性

潘志兰 杨彦 张永梅 张志敏 冯丽倩 邢英杰

目的研究急性髓系白血病(AML)患者中CXXC5基因的表达水平，并分析其与临床病理特征的相关性。方法应用EvaGreen实时定量PCR( RQ-PCR) 方法检测AML 患者中CXXC5基因表达量。结果结果显示与24例对照相比，94 例AML患者CXXC5转录本水平显著降低 (P<0.01)。44例(45.8%)AML 患者为CXXC5基因低表达，M1/M2/M3亚型患者CXXC5基因的低表达率显著高于M4/M5/M6 亚型(P<0.01)。CXXC5基因低表达的 AML患者总体生存时间(OS)显著长于非低表达者(P<0.01)。结论CXXC5低表达常见于AML患者中，且对AML预后具有良性影响。

白血病，髓系，急性；CXXC5；预后；实时定量PCR

急性髓系白血病(AML) 是一种造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖疾病，由造血干细胞/髓系祖细胞分化异常以及增生失控而引起[1,2]。该疾病的发生是一个多步骤事件，因多基因异常而使正常的造血干细胞丧失了自我更新能力和分化为多种成熟细胞系的能力，并同时转化为白血病干细胞而累积在骨髓中[3,4]。研究证实，很多基因包括BAALC、ERG、MN1、EV11和WT1，都在AML中表达失调，并且和AML患者的疗效和生存率都具有相关性[5,6]。CXXC5 (CXXC finger protein 5) 是最新鉴定的一种维甲酸敏感基因，它编码维甲酸诱导的核因子(RINF)。通过基因表达研究和应用基因沉默实验表明，CXXC5在正常造血功能中发挥着非常重要的作用[7]。该基因定位于染色体5q31.2，它的染色体异常与各种髓系恶性肿瘤疾病均相关，包括低风险5q突变的骨髓增生异常综合征(MDS)[8]和高风险5q缺失、5q突变的人类AML[9]。本实验中，我们研究了CXXC5基因在AML患者骨髓中的表达水平，以及该基因的表达与患者临床病理特征、预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 96例骨髓标本均取自2011年1月至2014年1月期间在河北省石家庄市第一医院血液科住院的初诊AML患者,诊断及分类标准按《血液病诊断及疗效标准》[10]。患者临床病理学特征见表1。对照组骨髓标本24例，其中包括19例缺铁性贫血(IDA)和5例免疫性血小板减少症患者。全部患者均于初诊时抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞。人类白血病细胞系(HL-60、NB4、THP-1、SHI-1、U937、HEL和K562)购自中国科学院上海细胞生物所。细胞采用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)于CO2培养箱(37℃、5% CO2)静置培养。当细胞生长状态良好并且融合度达到80%左右时，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化进行细胞传代。

1.2 总RNA提取和cDNA合成 细胞计数后，按106个/ml在1.5 ml eppendorf管中加入适量TRIzol试剂，提取总RNA。分光光度法测定纯度后取2.0 μg，应用随机引物逆转录合成第一链cDNA，总体系40 μl，含MMLV逆转录酶200 U、dNTP(每种0.5 mmol/L)，10 mmol/L DTT，RNAsin 25 μl，37℃逆转录1 h，95℃ 5 min灭活，cDNA保存于-20℃备用。

1.3 实时定量PCR(RQ-PCR) 应用EvaGreen染料(Biotium，美国)在7300扩增仪(ABI，美国)上完成RQ-PCR。CXXC5引物序列如下：上游引物，5’-GTGGACCCCTCGGCAGTTG-3’；下游引物，5’-CACACGAGCAGTGACATTGC-3’。PCR反应体系包括：dNTP 0.2 mmol/L，MgCl24 mmol/L，引物0.4 μmol/L，1×ROX，1.0 U Taq DNA聚合酶(MBI，美国)，和50 ng cDNA。反应条件：94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，于84℃30 s记录荧光量，共40循环，最后72℃延伸7 min。最终的溶解步骤按如下条件完成：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s。采用蒸馏水代替cDNA作为无标本对照(NTC)。标准率按如下公式计算：NCXXC5=(ECXXC5)ΔCT CXXC5(control-sample)÷(EGAPDH)ΔCT GAPDH(control-sample),其中，参数E公式：E=10(-1/slope)(斜率指CT与cDNA作图所得)。我们选择一例缺铁性贫血患者的骨髓标本，检测得到的最小ΔCT(CXXC5和GAPDH)作为对照。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，Chi-square分析和Fisher法计算各组间差异。CXXC5基因表达水平和临床病理特征相关性分析应用Sperman检测。Kaplan-Meier曲线和Cox regression用来分析CXXC5表达对生存率的影响，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXXC5基因在对照组中的表达 CXXC5基因在所有对照组病例标本中表达(0.17～1.00，0.49±0.19)。因此，将NCCXC5小于0.05(平均值±1.5标准差)设定为CXXC5基因在AML标本中低表达的阈值。

2.2 CXXC5基因在人类白血病细胞系和AML患者中的表达 在7种人类白血病细胞系中，只有K526和THP-1中有CXXC5的表达，分别为2.84和0.31，其余的5种细胞系都表现为CXXC5的低表达(0.00～0.01)。与对照组相比，CXXC5在96例AML患者中的表达显著下调(0.00～1.16，平均值0.07，P<0.001)。44例AML患者(45.8%)中CXXC5基因表达下调。见表1。

2.3 CXXC5基因表达与AML患者临床病理特征的相关性 CXXC5基因表达与FAB分型具有相关性，与M4/M5/M6亚型比较(13.6%)，有更多的M1/M2/M3亚型患者中的CXXC5基因低表达(86.4%，P<0.01)。CXXC5基因低表达率在5/5qAML患者和其他核型患者组中差异无统计学意义(P>0.05)。另外，CXXC5的低表达与患者性别、年龄、血常规指标和细胞遗传学风险均无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 CXXC5基因表达水平与AML患者临床病理特征的相关性

2.4 CXXC5表达对患者预后的影响 我们对96例AML患者进行了平均11个月的随访(1～72个月)。结果有15.4%(8/52) CCXC5高表达的患者生存，而CXXC5低表达的患者有45.5%(20/44)存活。经统计分析，CXXC5低表达的AML患者的总生存期(OS)长于非低表达CXXC5的AML患者(P<0.01)。多变量分析显示，CXXC5的表达水平、FAB亚型和细胞遗传学风险都是独立的预后影响因素。见表2、图1。

3 讨论

CXXC5基因定位于染色体5q31.2，染色体区域缺失可能与AML疾病有关。我们进行本实验的目的就是为了探讨该基因与AML的关系。研究表明，CCXC5基因在AML患者的人类白血病细胞中表达，但没有发现突变的CCXC5基因编码区，也没有检测到CCXC5 mRNA表达和FLT3-ITD或NPM1突变之间的关联[10]。CCXC5基因在AML患者循环细胞中相对高水平表达，高CCXC5表达与不良预后和临床化疗敏感性相关。有人观察了单核细胞分化和CCXC5基因表达之间的关联，这类似于正常的造血功能中CXXC5表达也依赖于髓系细胞的分化状态[11]。实验中发现患者有低水平的不良细胞遗传学异常，但考虑到非选择性患者具有很高的中位数年龄，因此结果有待商榷。另外，研究中也没能在任何患者中检测到CXXC5基因的突变[11]。

表2 多变量分析影响AML患者总生存率的因素，HR，危险率(CI，可信区间)

图1 CXXC5表达与预后的关系

有实验研究了接受五种不同强化化疗的初治AML患者人群中CXXC5基因表达和总生存期之间的关系，对于这些比较年轻的患者，总生存期主要体现在临床化疗敏感性，即原发性耐药和AML复发的频率[12]。高CXXC5表达水平和不良预后之间的关联在下面患者中都可见：(1)未经选择的患者;(2)患者具有正常的细胞遗传学特征；(3)基因异常是影响患者预后的核心因素。这些观察结果都支持CXXC5高表达与不良预后相关的假说,，而类似的高表达与不良预后相关的结果也在乳腺癌患者中被观察到[13]。

实验数据显示CCXC5介导了抗凋亡作用，可以作为治疗高危白血病的靶点。用典型AML细胞系，不成熟髓系白血病细胞K562来研究CXXC5表达对化疗药物敏感性的影响。实验表明，CXXC5基因敲除后增加了化疗诱导的细胞凋亡的敏感性。这一结果提示，CXXC5表达是化疗耐药白血病细胞的表型。通过比较高和低CXXC5表达的患者AML细胞体外培养，两个组表现出预期的自发性体外细胞凋亡。同时，在细胞培养液中加入目前用于白血病治疗的药物来那度胺[14]，它常用于治疗5q-异常和低CXXC5表达MDS患者[15]。结果证明细胞的存活是由自发的体外凋亡连同药物诱导的细胞凋亡共同发挥作用的。在低CXXC5表达组中，在体外培养过程中最大量的减少了AML细胞存活率是通过单独应激诱导凋亡达到的；而在高CXXC5表达组中，凋亡是由自发诱发和药物诱导联合引起的。上述结果都支持CXXC5是细胞凋亡重要的调控基因这一假设。

其他实验模型的研究也表明，药理学抑制人白血病细胞抗凋亡的细胞内信号传导，可诱导细胞凋亡或增加化疗的促凋亡效应[16]，因此CXXC5/RINF的靶向治疗可能是一种新的在人类白血病细胞中增加促凋亡活性和敏感性的策略。CXXC5/RINF沉默在AML细胞中的促凋亡活性的分子机制目前还不清楚。在神经细胞和肾脏发育的实验结果表明，WT1基因通过下调WNT-β-cathenin信号通路诱导CXXC5基因表达[17]。WT1和CXXC5/RINF表达之间的相关性可能表明，在原发性AML细胞中这两个分子之间发生了串扰。然而，WNT-β-cathenin通路可以在AML细胞中组成性激活，这种激活似乎介导了抗凋亡作用[18]。因此，CXXC5在AML细胞中的抗凋亡作用可能不是通过WNT-β-cathenin途径，而是通过其他机制激活促凋亡信号而发挥作用。RINF也表达于正常造血细胞，因此血液学毒性是抑制CXXC5治疗AML的一种可能性。CXXC5在正常骨髓细胞中表达不排除考虑其用于治疗白血病的可能性。一些患者尤其是高危患者表现为较高的白血病细胞水平，另外，生存能力不是由单一因素，而是由促或抗凋亡信号之间的平衡决定的。这种平衡决定了在正常和白血病细胞之间CXXC5基因抑制的后果。另外，结合不同的细胞凋亡调节途径，包括CXXC5靶向同时结合血液毒性学是一种很有前途的治疗癌症策略。

本实验中，我们检测了AML患者骨髓中CXXC5的表达，结果发现CXXC5低表达常见于AML中，并且在几种AML细胞中也有低表达。CXXC5的低表达是AML预后良好的一种预测指标。但是，有关CXXC5在AML中的作用和机制都有待进一步研究。

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CorrelationbetweentheexpressionlevelsofCXXC5geneandprognosisofpatientswithacutemyeloidleukemia

PANZhilan,YANGYan,ZHANGYongmei,etal.DepartmentofHematology,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo investigate the expression levels of CXXC5 gene in patients with acute myeloid leukemia (AML),and to explore its correlation with clinical pathological characteristics.MethodsThe expression levels of CXXC5 in 96 patients with AML (AML group) and 19 cases of iron deficiency anemia as well as 5 cases of immune thrombocytopenia (control group) were detected by RQ-PCR.ResultsThe expression levels of CXXC5 gene in AML group were significantly decreased,as compared with those in control group (P<0.01).The low-expression of CXXC5 gene was found in 44 cases of AML (45.8%).The low-expression rate (86.4%) in AML patients with M1/M2/M3 subtype was significantly higher than that of AML patients with M4/M5/M6 subtype (13.6%,P<0.01).The overall survival (OS) time in AML patients with low-expression of CXXC5 was obviously longer than that of AML patients with non low-expression of CXXC5 (P<0.01).ConclusionThe low-expression of CXXC5 is a common and favorable event in patients with AML,which is favorable to prognosis of AML patients.

AML；CXXC5；prognosis；realtime quantitative PCR

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.004

050011 河北省石家庄市第一医院血液内科

R 733.712

A

1002-7386(2014)15-2253-04

2014-01-06)