清瘟败毒颗粒的急性和亚慢性毒性试验研究

郭时金，徐倩倩，付石军，周春凤，王艳萍，沈志强*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都安特动物药业有限公司，山东 滨州 256600)

清瘟败毒颗粒的急性和亚慢性毒性试验研究

郭时金1,2，徐倩倩1,2，付石军1,2，周春凤1,2，王艳萍1,2，沈志强1,2*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都安特动物药业有限公司，山东 滨州 256600)

在急性毒性试验中，给予试验组小鼠不同浓度的清瘟败毒颗粒水溶液，测定清瘟败毒颗粒的半数致死量和最大耐受量；在亚慢性毒性试验中，试验组大鼠以88，44，22 g/(kg·d)的剂量连续经口给药42 d，并另设灌服生理盐水对照组，在给药后观察大鼠的生长发育、血液学和血液生化、脏器病理学变化。结果显示，急性毒性试验没能测出清瘟败毒颗粒的半数致死量；小鼠经口灌服受试药物的最大耐受量高于132 g/(kg·d)；在亚慢性毒性试验期间，各给药组大鼠体重、血液学指标、血液生化指标与对照组比较均无显著性差异。急性毒性试验表明清瘟败毒颗粒无急性毒性；亚慢性毒性试验表明连续口服给药较安全。

清瘟败毒颗粒；急性毒性试验；最大耐受量试验；亚慢性毒性试验

清瘟败毒饮是清代著名温病学家余师愚所创制的名方，载于其所著的《疫疹一得》书中。处方由生石膏、小生地、乌犀角、真川连、栀子、桔梗、黄芩、知母、赤芍、玄参、连翘、甘草、丹皮、鲜竹叶共十四味中药煎煮而成。处方是由白虎汤、黄连解毒汤和犀角地黄汤三副汤剂组成的复方，药性专一，作用全面，功在清热解毒，泻火凉血[1]。现代研究已报道，清瘟败毒饮具有抑制早期脓毒症患者过度免疫应答、减少过度免疫应答对机体自身的损害[2]、改善细胞免疫水平[3-4]、有较强的抑菌作用[5]。清瘟败毒散对鸡白痢[6]、猪高致病性蓝耳病[7]有良好地防治效果。

清瘟败毒颗粒是在清瘟败毒饮基础上对其中主要成分进行单独提取，并在此基础上通过科学工艺制备的颗粒剂。前期研究工作显示，清瘟败毒颗粒有很好的抗菌活性[8]，为了进一步探讨其安全性，本研究通过急性毒性试验、最大耐受试验、亚慢性毒性试验对其毒性进行了评价，为临床安全应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

血液生化测定试剂盒包括谷草转氨酶(AST，批号111206)、谷丙转氨酶(ALT，批号120321)、碱性磷酸酶(ALP，批号120214)、白蛋白(ALB，批号111220)、总蛋白(TP，批号120311)、尿酸氨(BUN，批号111128)、肌酐(CRE，批号120215)、总胆红素(TBIL，批号120307)，以上试剂均采用上海百祥生物科技有限公司产品。主要设备包括AUTOLAB-1.0全自动生化分析仪、ACS-30电子天平和血细胞计数板。

1.2 试验药物

清瘟败毒颗粒，1.3 g生药/g颗粒。批号20120210，经检验合格，由山东绿都安特动物药业有限公司提供。

1.3 试验动物

昆明系小白鼠，雌雄各半，体重18～22 g。在人工照明12 h，通风良好情况下饲养观察7 d；8周清洁级SD大鼠120只，雌雄各半，体重在210～240 g之间，均由山东大学试验动物中心提供，动物合格证号为：SCXK(鲁)20090001。室温18 ℃～25 ℃，相对湿度60%，室内无对流风。

1.4 急性毒性试验

1.4.1 方法 小鼠64只，随机分为8组，每组8只，雌雄各半，禁食不禁水12 h；将颗粒配制成不同浓度，一日三次，以最大给药体积0.8 mL/只，口服给药，给药剂量分别为11.6、17.4、26.1、39.1、58.7、88.0、132.0 g/(kg·d)及生理盐水对照组，连续观察7 d，详细记录动物毒性反应情况和死亡情况，计算半数致死量(LD50)的置信区间[8]。

1.4.2 评价指标 记录中毒症状、中毒发生时间、持续时间、恢复期、死亡数量等；对死亡动物及时进行尸检，记录病变情况。

1.5 最大耐受量试验

1.5.1 方 法 小鼠30只，禁食不禁水12 h，随机分为4组，即高、中、低和生理盐水对照组，给药剂量分别为132、66、33 g/(kg·d)，连续观察7 d。

1.5.2 评价指标 记录中毒症状、中毒发生时间、持续时间、恢复期、死亡数量等；对死亡动物及时进行尸检，记录病变情况；试验结束后每组小鼠脱颈处死，观察各脏器的病理变化。

1.6 亚慢性毒性试验

1.6.1 给药剂量与分组 将大鼠随机分为4组，每组30只，雌雄各半，即高、中、低剂量组和生理盐水对照组，给药剂量分别为88、44、22 g/(kg·d)。组内动物个体体重相差不超过平均体重的10%，组间平均体重相差不超过5%。

1.6.2 给药方法 根据清瘟败毒颗粒的用药原则，采用口服给药，连续给药42 d。根据体重和剂量组进行灌服给药，每天定时进行，每周称重1次，并按体重变化调整给药量。

1.6.3 检查项目与方法

1.6.3.1 一般指标 每天观察大鼠的健康状况、采食及饮水、体重变化等变化。分别于第1、2、3、4、5、6周称量体重，将给药剂量组与对照组进行比较和统计学处理。及时记录和分析大鼠的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间。

1.6.3.2 血液学检测 给药结束后静脉采血，测定血红蛋白(Hg)、红细胞计数(Ec)、白细胞计数(Lc)，嗜中性粒细胞(NL)、嗜酸性粒细胞(AL)、嗜碱性粒细胞(BL)、淋巴细胞(LM)、单核细胞(ML)。

1.6.3.3 血液生化指标检测 给药结束后静脉采血分离血清，检测丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸转换酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总蛋白(TP)、总胆固醇(CHO)。

1.6.3.4 脏器系数 试验结束后，各组取10只大鼠(雌雄各半)进行处死，对处死的大鼠进行全面系统的剖检，对大鼠体重及各主要脏器(包括心、肝、脾、肺、肾、睾丸及卵巢)重量，做好记录。计算各脏器的相对重量(脏器重/体重)，即脏器系数。

1.6.3.5 组织病理学检查 对高剂量组及对照组大鼠(如有异常则包括中、低剂量组)的主要脏器进行组织病理学检查。组织病理学检测项目包括：心、肝、肾、脾、睾丸(♂)及卵巢(♀)。

1.7 数据处理

2 结 果

2.1 急性毒性试验

给药后小鼠饮食正常，体重增加，活动自如，皮毛光滑，大小便正常，无异常分泌物，无任何不良反应。观察7 d，动物均无死亡，经大体解剖和病理检查，主要脏器无异常。

2.2 最大耐受量试验

急性毒性试验表明给药剂量达到132 g/(kg·d)时，小鼠没有出现死亡和中毒现象，同时由于受给药体积和浓度的限制，难以测出LD50，故进行小鼠的最大耐受量测定[9]。

以最大灌胃容量给予清瘟败毒颗粒，剂量最大达到132 g/(kg·d)，连续观察7 d，动物全部存活，饮食正常，体重增加，活动自如，皮毛光滑，大小便正常，无异常分泌物，无任何不良反应。剖检观察主要脏器未见异常。

2.3 亚慢性毒性试验

2.3.1 一般状况 试验期间，3个剂量组大鼠活动自如，皮毛光滑，大小便正常，无异常分泌物，无任何不良反应，未出现死亡。3个剂量组大鼠给药结束，体重与对照组相比均无显著差异(P>0.05)见表1。

2.3.2 血液学及血液生化指标检查 给药结束后，各组大鼠进行血液学和血液生化参数测定结果分别见表2和表3。统计学分析显示，与对照组相比清瘟败毒颗粒各剂量组的血液学和血液生化参数之间差异不显著(P>0.05)。

2.3.3 剖检观察和脏器系数 给药结束后，大剖检鼠，经肉眼观察均未发现任何异常和可疑病变。将清瘟败毒颗粒高剂量组和对照组大鼠的肝、肾、脾、胃肠、睾丸(♂)及卵巢(♀)组织进行组织病理学切片检查，结果均未发现异常的组织病理学变化。给药结束，三种不同剂量组各脏器系数与对照组均无显著性差异(P>0.05)见表4。

表1 清瘟败毒颗粒对大鼠体重增重的影响Table 1 Influence of Qingwen Baidu Granules to weight increment of rats

表2 清瘟败毒颗粒对大鼠血液学检测指标Table 2 Influence of Qingwen Baidu Granules to hematology detection index of rats

表3 清瘟败毒颗粒对大鼠血液生化学检测指标Table 3 Influence of Qingwen Baidu Granules to blood biochemical detection index of rats

表4 清瘟败毒颗粒对大鼠脏器系数的影响Table 4 Influence of Qingwen Baidu Granules to Organ coefficients of rats

3 讨论与结论

清瘟败毒颗粒由石膏、知母、栀子、黄连、黄芩、连翘等十四味中药经提取精制而成，具有突出的泻火解毒，凉血等作用。清瘟败毒饮在人类医学临床中未见不良反应发生，但是由于中药提取工艺不同，有效成分及含量亦不同，其毒副作用亦有区别。所以对清瘟败毒颗粒进行了小鼠的急性毒性试验和大鼠的亚慢性毒性试验。

3.1 清瘟败毒颗粒对小鼠的急性毒性

急性毒性试验是指一次或24 h内多次染毒的试验，是毒性研究的第一步。要求采用啮齿类或非啮齿类两种动物。通常为小鼠或大鼠采用经口、吸入或经皮染毒途径。观察药物对小鼠的毒性反应,同时考察小鼠的急性毒性反应情况、中毒死亡的原因及特征，以期对制剂的毒性做出评价。本次急性毒性试验，由于受给药体积和浓度的限制，未能测定出清瘟败毒颗粒对小鼠的LD50，所以进行了最大耐受量试验。试验结果显示小鼠灌服清瘟败毒颗粒132 g/(kg·d)[生药量171.6 g/(kg·d)]后观察7 d，也未见死亡，剖检观察主要脏器，均未见异常。因此小鼠对清瘟败毒颗粒的最大耐受量超过132 g/(kg·d)[生药量171.6 g/(kg·d)]。

3.2 清瘟败毒颗粒的亚慢性毒性

亚慢性毒性是指试验动物连续多日接触较大剂量的外来化合物所出现的中毒效应。主要是探讨长期用药后，对机体所产生的毒性反应及其严重程度、主要的毒性靶器官，提供无毒性反应剂量，为临床设计动物用药剂量和主要观察指标提供参考。

清瘟败毒颗粒连续给药42 d后，清瘟败毒颗粒各剂量组的大鼠增重、摄食、血常规及血液生化值与对照组相比均未发生显著性变化(P>0.05)；组织学观察肝、肾、脾、胃肠、睾丸(♂)及卵巢(♀)等组织亦均未发现异常的组织病理学变化。

综上所述，急性、亚慢性毒性试验结果表明清瘟败毒颗粒毒性很低或无毒性反应。

[1]黄荣宗,陈焕泓.医方临症指南[M].北京: 中国中医药出版社,1998：70-72.

[2]冷建春,王卫星.清瘟败毒饮治疗脓毒症临床疗效及对部分血清免疫学指标的影响[J].中国中医急症，2010,19(9):1 483-1 484.

[3]邢 聪,尉成东.加减清瘟败毒饮治疗多重耐药性伤寒疗效及T淋巴细胞亚群观察[J].新中医，1997,29(10):9-11.

[4]李绍民,于立丽.清瘟败毒饮治疗肾综合症出血热发热期作用机理的探讨[J].黑龙江医药科学，2010,33(6):23-24.

[5]宁官保,郑明学,温伟业.畜禽清瘟败毒散和泻痢康的体外抑菌试验[J].中国兽医杂志，1999,33(2):56-58.

[6]宁官保,郑明学,温伟业.畜禽清瘟败毒散对鸡白痢的防治效果[J].中国兽医杂志，1998,12(24): 34.

[7]唐耀平,周双海.三种中药对高致病性猪蓝耳病的防治效果试验[J].畜禽业，2008(3):53-54.

[8]郭时金.清瘟败毒颗粒的制备及药理学研究[J].吉林长春：吉林大学，2012.

[9]沈建忠.动物毒理学[M].北京: 中国农业出版社,2002：12.

[10]国家食品药品监督管理局.药物研究技术指导原则[M].北京: 中国医药科技出版社,2005：209-216.

StudyontheAcuteandSub-chronicToxicityofQingwenBaiduGranules

GUO Shi-jin1,2，XU Qian-qian1,2，FU Shi-jun1,2，ZHOU Chun-feng1,2，WANG Yan-ping1,2，SHEN Zhi-qiang1,2*

(1.BinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong256600,China; 2.ShandongLvduAnteVeterinaryDrugCo.,Ltd.,Binzhou,Shandong256600,China;)

In the acute toxicity test,different concentrations of solution of Qingwen Baidu Granules were provided to the mice in the experimental group to determine the median lethal dose (LD50) and maximum tolerable dose (MTD); in the sub-chronic toxicity test,the rats in the experimental group were given solution of Qingwen Baidu Granules with 88,44 and 22 g/(kg·d) for consecutive 42 d,and the control group were fed physiologic saline,observing the growth,haematology,and blood biochemical indexes as well as the organ pathology of rats.The results show that the acute toxicity test failed to determine LD50; the MTD of mice was above 132 g/(kg·d);during the sub-chronic toxicity test,the rats of different groups had insignificant differences in body weight,Hematology indexes,blood biochemical indexes compared with the control.The acute toxicity test indicates that Qingwen Baidu Granules is not acutely toxic; while the sub-chronic toxicity shows that a consecutive oral dose is safer.

Qingwen Baidu granules; acute toxicity test; maximum tolerable dose (MTD); sub-chronic toxicity test

2013-01-14，修改回日期：2013-01-31

山东省技术创新项目(20120916001)

郭时金(1974-)，男，四川内江人，硕士，助理研究员，主要从事新兽药的研发与应用。E-mail: gsj7877@126.com

*[通讯作者]沈志强(1963-)，男，山东荣成人，研究员，从事预防兽医学研究。E-mail: bzshenzq@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0061-04