牦牛FSHR基因5′端部分序列克隆及生物信息学分析

李 雯，罗 虹，柴志欣，钟金城*

(1.云南省种畜繁育推广中心冷冻精液站，昆明 云南 650212；2.动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室，西南民族大学，四川 成都 610041)

牦牛FSHR基因5′端部分序列克隆及生物信息学分析

李 雯1，罗 虹2，柴志欣2，钟金城2*

(1.云南省种畜繁育推广中心冷冻精液站，昆明 云南 650212；2.动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室，西南民族大学，四川 成都 610041)

利用PCR和T-A克隆技术，测定了麦洼牦牛和杂种犏牛的FSHR基因5′端侧翼区和第1外显子的核苷酸序列，并运用BLAST、DNAMAN、Clustal等生物信息学软件与其他物种的相应序列进行了同源性比对分析，为牦牛FSHR基因结构、犏牛雄性不育、牦牛遗传多样性，以及FSHR基因与牦牛的繁殖、产肉、产奶性状相关分析提供了理论基础。结果表明：牦牛和犏牛FSHR基因5′端侧翼区长度为970 bp，普通牛、羊和猪的该序列长度分别为970、973和981 bp，序列长度差异较小；序列突变以碱基替换为主，牦牛与犏牛、普通牛、羊及猪的核苷酸序列一致性分别为99.4%、99.3%、98.2%、96.9%，一致性较高，为同源基因。聚类分析中牦牛与犏牛首先相聚，再依次与普通牛、羊、猪聚在一起。根据核苷酸序列推测，氨基酸组成分析显示，牦牛和犏牛的该蛋白疏水性，蛋白的亲水性和稳定性较差，为不稳定的脂溶性蛋白；二级结构主要以α螺旋和随机卷曲为主。

牦牛；FSHR；基因克隆；序列分析

FSH是下丘脑分泌的一种多肽类物质，是FSH/LH/细胞因子受体超家族成员之一，能促进活化芳香化酶及诱导LH(促黄体素)受体的形成[1,2]。FSH能与FSHR结合，并由FSHR介导将信号传入细胞内而产生一系列催化效应及机体免疫应答，从而对细胞代谢或功能活动产生影响。鉴于FSHR基因对繁殖性能的特殊调节作用，作为侯选基因广泛用于动物繁殖育种研究中。目前，随着动物基因组计划的开展和实施，功能基因的克隆测序和定位已成为动物遗传育种研究的热点之一[3-6]。FSHR基因在羊、猪、普通牛等物种中研究较为广泛[7-9]，刘永斌等[10]通过对巴美肉羊FSHR基因第10外显子的PCR-SSCP多态性检测来探讨该基因对巴美肉羊繁殖力的影响；陈洋等[11]利用VEGF对绵羊卵泡颗粒细胞FSHR表达水平的分析中发现，生殖激素FSH在卵泡颗粒细胞的增殖和分化过程中起决定作用，且FSHR mRNA主要存在于各级时期的卵泡颗粒细胞中；吴井生等[12]研究发现FSHR基因第1外显子的多态性对小梅山猪TNB和NBA具有显著性影响。而在牦牛中研究较少，王明亮等[13]通过对牦牛FSHR基因5′端及第1外显子的多态性研究发现，该区域存在9个突变位点，其部分基因型有缩短牦牛产犊间隔的趋势。本研究对牦牛和犏牛FSHR基因5′端侧翼区进行T-A克隆测序，并与NCBI中普通牛、羊及猪等物种相应序列进行比对分析，旨在为进一步开展牦牛功能基因定位和分子育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在麦洼牦牛和犏牛的主产区选取健康成年的牦牛个体为试验材料。颈静脉采血(10 mL/头)，EDTA抗凝带回实验室， 20 ℃保存备用。样品采集地和数量见表1。

1.2 基因组DNA提取及检测

采用酚-氯仿法提取基因组DNA[10]，用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计双重检测DNA的纯度和质量浓度， 20 ℃保存备用。

1.3 引物设计与PCR扩增

综合应用primer 5.0、Oligo 6.0生物软件对FSHR基因5′端侧翼区部分片段设计引物。PF:5′-AATTCATTTGTGCCAGCATCC-3′;PR: 5′-AGTTCGACCGCATCCCTG-3′，覆盖片段长度为970 bp。引物合成由上海基康生物技术有限公司完成。

PCR反应体系为25 μL。其中，DNA模板5 μL(25 ng/μL)，上下游引物各5 μL (10 pmol/μL)，ddH2O 19.7 μL，Ex Taq 0.3 μL(5 U/μL)，10×Ex Taq Buffer(Mg2+free)5 μL，MgCl25 μL(25 mM)，dNTP Mixture 5 μL(25 mM)。

表1 试验动物、采样地点及采样地生态条件Table 1 Expermental animal,sampling place and ecological condition

PCR扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性45 s，62.0 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 克隆测序

将回收纯化的目的片段与pMD18-T载体充分混匀，在恒温金属浴中16 ℃连接2 h，将全量连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素、200 mg/mL IPTG 及20 mg/mL X-Gal 的LB平板，过夜培养。经PCR筛选阳性克隆进行测序。

1.5 序列分析

测序结果用DNAMAN 、Version 5.2.10 Demo (Lynnon BioSoft)等生物信息学软件进行拼接，对牦牛、犏牛、普通牛、羊、猪的FSHR基因5′端侧翼区的核苷酸序列进行比较分析，根据比对结果计算物种间核苷酸一致性比率。利用在线蛋白分析软件(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)中ProtParam程序分析预测氨基酸的理化性质(氨基酸的组成、相对分子生量、理论等电点、蛋白质的亲疏水性及稳定性等)，SignalP 4.0 Server程序预测蛋白质序列的信号肽，CDD分析软件对蛋白的保守结构域进行预测。

2 结果与分析

2.1 PCR产物扩增

经琼脂糖凝胶电泳检测，牦牛及犏牛FSHR基因5′端侧翼区PCR产物大小为约970 bp，扩增片段与目的片段大小一致，且特异性好(图1)。

2.2 重组子的测序

将PCR扩增为阳性的克隆子，过夜培养，将菌液送到上海基康公司进行测序。菌液PCR扩增鉴定结果见图2。

图1 牦牛FSHR基因5'端的PCR扩增结果Fig.1 PCR products of 5'of FSHR gene in Yak

图2 菌液PCR扩增鉴定结果Fig.2 Electrophoresis of a recombinant plasmid sample

2.3 FSHR基因5′端侧翼区序列一致性分析

将克隆测序所得的牦牛及犏牛FSHR基因5′端侧翼区序列与普通牛(GenBank Accession NO NW_001492929.1)、羊(GenBank Accession NO NW 001009289)和猪(GenBank Accession NO AF025377)的FSHR基因5′端侧翼区序列进行比对，其中牦牛与犏牛一致性最高(99.4%)；与普通牛、羊和猪的序列一致性分别为99.3%、98.2%和96.9%(表2)。经序列比对分析发现，碱基变异类型主要表现为转换和颠换，转换的次数大于颠换的次数，存在插入和缺失现象。牦牛、犏牛及普通牛FSHR基因5′端侧翼区核苷酸序列间碱基变异最少，遗传距离最近，一致性最高，具有较高的序列保守性。牦牛、犏牛与普通牛FSHR基因5′端侧翼区核苷酸序列高度同源，具体情况如下：麦洼牦牛与普通牛相比，发生1次缺失，6次碱基转换和3次碱基颠换，85、210、962位碱基转换(A←→G)，231、651、914位碱基转换(T←→C)，271位碱基颠换(C←→A)，18、844位碱基颠换(T←→A)，132位发生碱基缺失；犏牛与普通牛相比，发生1次碱基插入、7次碱基转换和7次碱基颠换，59、85、962位碱基转换(A←→G)，231、657、820、914位碱基转换(T←→C)，271、671、502位碱基颠换(C←→A)， 11位碱基颠换(T←→G)，18、460、485位碱基颠换(T←→A)，766位碱基插入。同时，在犏牛核苷酸序列第502位A←→C突变导致FSHR基因5′端启动子元件TATA盒发生突变。

表2 牦牛、犏牛和普通牛FSHR基因5′端侧翼区序列间一致性Table 2 The homology of FSHR gene 5′flank region of yaks、pianniu and cattle %

2.4 FSHR基因的5′端侧翼区SNP比较

不同物种间FSHR基因5′端侧翼区的SNP位点数存在差异(表3)，共发现43个非同源性核苷酸位点，多态频率变化范围在0.007～0.034之间。含2个单碱基变异多态位点的共有5处，分别为232、392、452、582、744位点。

表3 不同物种间FSHR基因的5′端侧翼区序列SNP比较Table 3 FSHR gene 5′flank region of SNP comparison results

2.5 FSHR蛋白质的氨基酸分析及结构预测

预测麦洼牦牛和犏牛FSHR蛋白分子量分别为80518.1 Da、80715.4 Da，等电点均为PI=5.05，其不稳定指数分别为51.86、52.74，属于不稳定蛋白；脂质指数分别为27.55和27.53，Hydropathicity (GRAVY)分别为0.875、0.885(Hydropathicity>0，疏水；Hydropathicity<0亲水)，显示该蛋白为疏水性结构蛋白。牦牛和犏牛FSHR蛋白均不存在信号肽。

通过CpG岛在线分析软件发现，牦牛和犏牛FSHR基因5′端侧翼区序列中并不存在CpG岛。利用NCBI在线CDD分析软件对牦牛和犏牛FSHR蛋白的保守结构域进行预测。由图3可知，牦牛和犏牛FSHR蛋白在其N端均含有一个亮氨酸富集重复结构域，在该区域短的序列片段中存在一些具有多样化功能和细胞定位的蛋白质，通常存在于半胱氨酸域的两侧。

图3 牦牛和犏牛FSHR蛋白的保守结构域分析Fig.3 Conserved domain of protein about FSHR

利用在线分析软件ExPASy中SOPMA程序进行二级结构预测。该蛋白主要由α螺旋(Alpha helix)、延伸链(Extended strand)、β转角(Beta turn)、随机卷曲(Random coil)组成(图4)。其中主要为α螺旋和随机卷曲，其他含量均较少。

通过工具PSORTⅡ预测FSHR编码产物的亚细胞定位，其分布在质膜的可能性是56.5%，分布在内质网膜的可能性为34.8%，在空泡和高尔基体中也有少量分布均为4.3%。因此可以推断，牦牛和犏牛FSHR 编码产物可能主要在质膜中发挥生物学功能。

图5 牦牛和犏牛FSHR蛋白二级结构预测Fig.5 Secondary structure prediction of FSHR protein

3 讨 论

FSHR属于糖蛋白激素家族，调控促卵泡激素(FSH)的分泌和表达，在繁殖过程中起着重要的调节作用。在哺乳动物中FSHR基因是被深入广泛研究的基因域，其基因组具有较丰富的遗传多态性，且目前的研究主要集中在FSHR基因5′调控区及第10外显子。许艳丽等[15]研究发现牛FSHR基因外显子4与绵羊该序列同源性达到100%，与大鼠同源性最低83%。王明亮等[16]通过对黄牛FSHR基因的理化性质、蛋白结构及生物学功能进行了生物信息学分析，发现该基因较为保守。魏伍川等[17]通过对西门塔尔牛FSHR基因5′侧翼序列的多态性分析发现存在TapⅠ酶切多态性，该基因与牛的繁殖性状存在连锁相关。魏伍川等[18]研究还发现牦牛FSHR基因第10外显子存在2处错义突变。

本研究通过对牦牛及犏牛FSHR基因5′端侧翼区序列的克隆分析，表明牦牛和犏牛FSHR基因5′端侧翼区长度为970 bp，普通牛、羊和猪的该序列长度分别为970、973和981 bp，说明几个种群的序列长度差异较小。共发现43个非同源性核苷酸位点，多态频率变化范围在0.007～0.034之间，序列突变以碱基替换为主，碱基的插入缺失会导致DNA构象的改变，影响基因的转录调控，这些突变位点是否与FSHR基因的繁殖性能相关，还有待验证。通过分析FSHR的编码产物，推测出FSHR蛋白由323个氨基酸组成，牦牛和犏牛所测多肽链表现为疏水性，说明该蛋白的亲水性和稳定性较差，为不稳定的脂溶性蛋白，这与王明亮等[19]研究结果一致。FSHR编码产物的二级结构主要以α螺旋和随机卷曲为主，主要在质膜中发挥生物学作用。保守结构域预测结果表明，该编码产物含有亮氨酸富集重复结构域，具有细胞定位等多样化的功能。通过序列比对分析发现，犏牛核苷酸序列第502位A←→C的颠换突变较为明显，导致FSHR基因5′端启动子元件TATA盒发生突变，这与牛金涛等[20]研究发现水牛FSHR基因5′端启动子区中存在TATA盒基元的结果一致，且在水牛、山羊和牛之间没有碱基差异，说明启动子区域在不同物种间高度同源并发挥相同的调节功能。因此，FSHR基因的表达调控可能是造成牦牛、犏牛、普通牛、羊及猪个体繁殖性状差异的原因之一。

通过对FSHR基因5′端侧翼区序列同源性比较可知，牦牛与犏牛、普通牛、羊及猪之间该基因一致性极高，在所扩增的970 bp片段中，仅有7、7、29和46位点不同，核酸变异率为0.6%、0.7%、1.8%和3.1%。这一结果与已报道的牦牛的GH基因、FSH基因和LH基因的研究结果相似，暗示了牦牛与犏牛和普通牛之间功能基因的碱基序列一致性高，同一种属内保守性极强；而与羊及猪之间序列差异较大，有较多插入和缺失发生，该基因片段具有种间差异性。因此，在不同的牛种之间可开展比较遗传学研究，利用普通牛中已定位和克隆的主基因(QTL)或DNA标记来分析研究牦牛主要繁殖性状的主基因，并定位于牦牛染色体上，进而加快牦牛功能基因组研究和主基因定位的速度。通过对比研究发现，牦牛和犏牛FSHR基因及其编码产物的理化性质、序列特征、蛋白质结构及生物学功能预测与其他哺乳动物FSHR相关结构功能极为相似，说明FSHR基因及其编码产物具有较强的相似性。牦牛和犏牛FSHR基因5′端侧翼区序列中并不存在CpG岛。通常蛋白质高级结构中包含着许多功能结构域，不同的功能结构域各司其职决定着该蛋白特殊功能。通过对保守功能结构域的预测，推测出蛋白质的生物学功能。

4 结 论

牦牛和犏牛FSHR基因5′端侧翼区序列与普通牛、羊和猪该序列长度差异较小，一致性较高，为同源序列，突变以碱基替换为主。牦牛和犏牛的FSHR蛋白疏水性、蛋白的亲水性和稳定性较差，为不稳定的脂溶性蛋白；二级结构主要以α螺旋和随机卷曲为主。

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CloningandSequenceAnalysisof5'FlankRegionofFSHRGeneinYak

LI Wen1,LUO Hong2,CHAI Zhi-xin2,ZHONG Jin-cheng2*

(1.StationofFrozensemen,YunnanExtensionCenterforAnimalBreeding,Kunming,Yunnan650212,China；2.KeyLaboratoryofAnimalGeneticsandBreeding,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041,China)

The complete sequences of FSHR 5′flank region (5′flank region and exonⅠ) of Maiwa yaks and Pianniu were determined by PCR (polymerase chain reaction) method and the T-A clone method,then the homologous analysis of the complete sequences of the FSHR 5′flank region between Maiwa yaks and Pianniu and other species was conducted through bioinformatics softwares such as BLAST,DNAMAN,Clustal,etc.,hoping to provide theoretical support for the future researches and studies on the gene structure of FSHR,Dzo male sterility,Yak genetic diversity,and correlation analysis on FSHR Gene and the breeding,meat production,and milk production traits of yaks.The research results showed that FSHR 5′flank region sequence length is 970 bp,and those of cattle,sheep and pigs are 970,973 and 981 bp,only with slight difference in between.Sequence mutation was mainly in the form of base substitution; the nucleoside sequences homology of yak,pianniu,cattle,sheep and pig are 99.4%,99.3%,98.2%,96.9% respectively.Yak has the closest relationship with pianniu followed by cattle,sheep,and then pig.According to the analysis of amino acid components predicted by the nucleoside sequence,FSHR protein in Yak and Pianniu is unstable,having poor hydrophobicity,hydrophilicity,and stability,and its secondary structure is mainly helix and randomly coiled.

yak; FSHR; cloning; sequence analysis

2013-10-04，

2013-11-05

国家科技支撑计划课题(2012BAD13B06)；中央高校科研专项基金项目(No．11NZYTH03)

李 雯(1968-)，女，云南德宏人，畜牧师，主要从事畜牧技术推广和冻精生产管理工作。E-mail：yngdwen@163.com

*[通讯作者]钟金城(1963-)，男，云南绿春人，博士，教授，主要研究方向：动物遗传学。E-mail：zhongjincheng518@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0015-06